2018 Fiscal Year Research-status Report
Small-molecule induced –1 ribosomal frameshifting and its application to the control of protein transport and localization
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18K05355
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
村田 亜沙子 大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (50557121)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | リボソーマルフレームシフト / RNA二次構造 / 翻訳制御 / 合成小分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，「小分子で駆動する-1リボソームフレームシフト（-1PRF）とタンパク質の輸送局在制御への応用」である。本年度は以下の①を主に実施し，②の条件検討を行った。①化合物誘起型に改変したウイルス由来シュードノット配列を用いる-1PRFの制御: 当研究室で独自に開発したNCT誘導体が，CGG/CGG配列を含む改変VPK(Variant pseudoknot of mouse mammary tumor virus) 配列に結合してシュードノット構造を誘起すること，また，改変VPK配列を導入したmRNAに，-1PRFを介した融合タンパク質合成を誘導できることを最近明らかにした。しかし-1PRF効率が低く，最適化の必要があった。そこで，VPK配列と比べて高いフレームシフト効率が望めるSRV-PK (Simian retrovirus-1 pseudoknot) をNCT誘起型にした改変SRV-PKをデザインした。M-SRVa, M-SRVb, M-SRVdの三種類の改変SRV-PKについて，NCT結合に伴う二次構造変化をゲルシフトアッセイにより確認したところ，M-SRVbのみ二次構造変化が観察された。そこでM-SRVb配列を二種類のルシフェラーゼ配列の間に挿入したmRNAを作製し，NCT誘導体の添加による-1PRFへの効果を評価した。
②ゲルシフトアッセイおよびFACSを利用した,化合物誘起型シュードノット配列の探索: -1PRFの効率を最大にするNCTn誘導体とRNA配列の組み合わせを得るために, セレクション法を適用する。本研究では，②-1ゲルシフトアッセイにより，化合物の結合に伴い二次構造が誘起されるRNA配列を分離・精製,濃縮する方法, および②-2 FACSによる配列探索を行うことにした。本年度は，②-1についてライブラリー調製条件の検討を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①化合物誘起型に改変したウイルス由来シュードノット配列を用いる-1PRFの制御: おおむね順調に進展している。"研究実績の概要"に示したように，新規にデザインした改変SRV-PKであるM-SRVbが，NCTの結合によりその二次構造が変化することが分かった。M-SRVb配列を二種類のルシフェラーゼ配列の間に挿入したmRNAを作製し，それを鋳型としてNCT誘導体の有無でin vitro翻訳反応を行い，NCTの-1PRFへの効果をデュアルルシフェラーゼアッセイにより評価した。その結果，NCTの添加に伴い-1PRF効率の低下が観察され，期待した二次構造を形成していないことが示唆された。そこで，新たにデザインしたM-SRVe, M-SRVf, M-SRVg, M-SRVh, M-SRViで同様のゲルシフトアッセイを行った結果，すべての改変SRV-PKで何らかの二次構造変化が観察された。今後はこれらの改変SRV-PKのさらなる評価を行う予定である。
②ゲルシフトアッセイおよびFACSを利用した,化合物誘起型シュードノット配列の探索: やや遅れている。"研究実績の概要"に示した通り，②-1ゲルシフトアッセイにより，化合物の結合に伴い二次構造が誘起されるRNA配列を分離・精製,濃縮する方法についてライブラリー調製条件の検討を行った。その結果，ライブラリー調製の工程のひとつである"RNAライブラリーとアダプターDNAのライゲーション"の効率が予想していたより低く，また，逆転写，PCR等により目的の長さのDNA断片を増幅することができなかった。今後は，反応条件およびライブラリーのランダム配列長の検討などが必要であると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
2018年度に得られた研究成果をもとに，新たにデザインしたNCT誘起型改変SRV-PK導入したmRNAについて，NCT誘導体の-1PRFへの効果を検証するとともに，シグナルペプチドの付加を介したタンパク質の輸送局在制御に応用する。また，セレクション法を用いた化合物誘起型シュードノット配列の探索については，ライブラリー調製の条件検討を行う（研究項目②-1）とともに，②-2 FACSによる配列探索に着手し，-1PRF効率を最大化する配列・化合物ペアの取得を目指す。
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| Causes of Carryover |
研究を進めるにあたって必要に応じて研究費を執行したため，当初の見込み額と執行額は異なったが，研究計画に大きな変更はなく，前年度の研究費も含め，当初予定していた計画に沿って研究を進める。
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