2020 Fiscal Year Research-status Report
Small-molecule induced –1 ribosomal frameshifting and its application to the control of protein transport and localization
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18K05355
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
村田 亜沙子 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (50557121)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | リボソーマルフレームシフト / RNA二次構造 / 翻訳制御 / 合成小分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、「小分子化合物で駆動する－1リボソームフレームシフト（－1PRF）とタンパク質の輸送局在制御への応用」である。目的達成のために、以下の２つの研究計画を実施することとした。
①化合物誘起型に改変したウイルス由来シュードノット配列を用いる－1PRFの制御
②ゲルシフトアッセイおよびFACS(Fluorescence activated cell sorting)を利用した、化合物誘起型シュードノット配列の探索
以上の研究計画を実施することにより、「化合物誘起型シュードノット配列を用いた－1PRFによる融合タンパク質合成」を検証し、並行して「－1PRFを介した融合タンパク質合成の効率を最大にする低分子化合物とRNA配列の組み合わせ」をセレクション法により探索・選別する。最終目標として、それら化合物とRNA配列を用いて小分子で駆動する－1PRFおよびそれによるタンパク質の輸送局在制御の具体例（核移行シグナル、細胞膜局在シグナルの付加）を実施する」ことにより、本研究の方法の有用性を示す。
今年度は次の研究計画を実施した。②ゲルシフトアッセイおよびFACSを利用した、化合物誘起型シュードノット配列の探索: －1PRFの効率を最大にする化合物とRNA配列の組み合わせを得るために、 セレクション法を適用する。FACSによる配列探索の可能性を評価するために、ランダム領域を含むVPK配列ライブラリーを２種類の蛍光タンパク質の間に導入したレポータベクターを作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
②ゲルシフトアッセイおよびFACSを利用した、化合物誘起型シュードノット配列の探索: 前年度までに、化合物誘起型改変VPK配列を２種類の蛍光タンパク質（iRFP670、 EmGFP）の間に導入したレポータベクターを作製した。このレポーターベクターを導入したHeLa細胞において、化合物依存的な蛍光タンパク質の発現量の変化をFACSおよび蛍光イメージャーにより観測した。これにより、FACSによる化合物標的配列探索の可能性が示された。この結果を受けて、ランダム領域を含むVPK配列ライブラリーを同レポーターベクター導入したプラスミドを作製したが、想定されるライブラリーの多様性（4塩基x10箇所のランダム化=1048576種類の配列多様性）を大きく下回る配列多様性しか得られなかった。今後は、改変VPK配列ライブラリーの導入条件を検討し、ライブラリーの配列多様性を保持したレポーターベクターを得ると同時に、ランダム化する塩基数を減らす等の検討を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度に得られた研究成果をもとに、VPK配列ライブラリーを導入したレポーターベクターを作製し、FACSによる化合物誘起型シュードノット配列の探索を行う。このため、VPK配列ライブラリーの配列多様性を最大限に保持したレポーターベクターの作製を早急に進める。
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| Causes of Carryover |
研究を進めるにあたって必要に応じて研究費を執行したため、研究計画に大きな変更はなく、当初予定していた計画に沿って研究を進める。
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