2018 Fiscal Year Research-status Report
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18K05358
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| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
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Principal Investigator |
坂本 寛 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 教授 (70309748)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平 順一 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 助教 (20549612)
森本 雄祐 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 助教 (50631777)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ヘム / センサー / プローブ / イメージング / FRET |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Ⅰ．Ａ 蛍光蛋白質融合型HO-1（第2世代ヘムセンサー）の改良 ②細胞内ヘムのイメージングに向けた第2.5世代の作製：従来の消光型センサーはヘム量を蛍光強度変化で評価しているため、センサーの発現量とヘムの増減を同一に評価してしまい、正確な定量を困難にすることが考えられる。そこで、蛍光強度変化ではなく，FRETによる色調変化を検出に応用したセンサー（YFP－D140H－CFP）の作製を行った。③ヘムオキシゲナーゼ1（HO-1）以外を母体としたさらに高いヘム親和性をもつセンサーの作製：細胞内酵素であるHO-1よりも血中の余剰ヘムのスカベンジングを行う血漿糖タンパク質であるヘモペキシン（Hx）がセンサーのヘム結合タンパク質として有望であると考え、従来のD140Hの代わりに1) Hxを用いたin vitroヘム検出法の開発を試みた。
Ⅱ．Ａ 生体由来サンプル中ヘム測定方法の確立：血清サンプル中の遊離ヘムの精密な定量に向け、非特異的に結合したヘムの遊離処理について検討を行うとともに、生体物質に非特異的に結合して存在するヘムの量を評価するために、消光したヘムセンサーの蛍光を回復させる新たな利用法の検討も行った。
Ⅱ．Ｂ 細胞内ヘムのバイオイメージング解析：①蛍光顕微鏡を用いた細胞内遊離ヘムのイメージング：一過的にこのプローブを細胞内に発現させると、発現量のばらつきによって定量が困難になることが懸念される。そこでまず、発現量の変動が生細胞におけるヘムの定量に及ぼす影響を考慮するため、EGFP-D140Hの一過性発現細胞株を作製し、発現量変動が緩やかな時間域を探索した。そしてヘム生合成を亢進する5-アミノレブリン酸(5-ALA)で処理し、生細胞内においてヘム濃度変化に基づいた蛍光消光が起こるのかを検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Ⅰ．Ａ 蛍光蛋白質融合型HO-1（第2世代ヘムセンサー）の改良：②YFP－D140H－CFPを用いたin vitroでの機能評価において、異なる濃度のセンサーがヘミン依存的な蛍光強度比（YFP/CFP比）の変化を示したことから、ヘム検出が可能であることが示唆された。哺乳細胞での機能評価において、ヘミン添加によりYFP/CFP比が減少したことから、YFP－D140H－CFPは色調変化型ヘムセンサーとして哺乳細胞で利用可能であると考えられる。③哺乳細胞で発現させた粗精製EGFP－hHxでは、ヘミン添加に伴いEGFP由来の蛍光強度の減少が観察された。血液サンプルなどの夾雑物を多く含む試料中からヘムを検出できることが示唆された。
Ⅱ．Ａ 生体由来サンプル中ヘム測定方法の確立：ヘミンとウシ血清アルブミンを共存させた非特異結合ヘムのモデルを用いたところ、非イオン性界面活性剤（Tween20、Triton X-100）によってヘムを遊離できる可能性が示唆された。また、生体サンプルに吸着されるヘム量を評価する方法として、ヘムで飽和したセンサーからのヘムの遊離に起因する蛍光回復が指標として利用可能であることが示された。
Ⅱ．Ｂ 細胞内ヘムのバイオイメージング解析①哺乳細胞へのトランスフェクション後72時間までEGFP-D140Hの発現量は増大し、その後はほぼ一定であった。2 mM 5-ALAで処理した細胞の蛍光強度と未処理の細胞の蛍光強度の間に有意な差は生じなかったが，50mM処理では、蛍光強度が約60%減少し、未処理の細胞の蛍光強度との間に有意な蛍光強度差が生じた。細胞ライセート中のヘム量は、50 mM 5-ALA処理によって約2倍上昇していたことから、この蛍光強度減少は生細胞内ヘム濃度上昇によって生じたことが示唆された。しかし、このとき培地のpH変化が生じて細胞死が起きた可能性がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
Ⅰ．A 蛍光蛋白質融合型HO-1（第2世代ヘムセンサー）の改良：広い濃度域のヘムに対応するため，ヘム親和性の異なるプローブを作製する：これまでのHO-1の酵素活性に関する我々の研究から，ヘムとの結合に関わるHO-1のアミノ酸残基（Lys18, His25, Asp140, Lys179, Arg183）をAlaに置換するとヘム親和性が10分の1から1000分の1に低下する知見が得られており，この置換を本年度開発した色調変化型ヘムセンサーに適用する。
Ⅰ．B 蛋白質-蛋白質間相互作用を利用した発光型ヘムセンサー（第3世代）の構築：細胞内イメージングには，発光型センサーの方が有利である。そこで，HO-1とシトクロムP450還元酵素（CPR）との特異的蛋白質間相互作用を利用して，FRETによりヘムを検出するセンサーを作製する。HO-1とdeltaTGEEの順番とリンカー長，ドナーとアクセプター蛍光蛋白質の導入位置をシミュレーションで検討した上で，数種の大腸菌発現用ベクターを作製する。
Ⅱ．B 細胞内ヘムのバイオイメージング解析：一般的哺乳細胞でヘム量の変動を確認できたら，免疫細胞を用いた実験に移行するが，B細胞への遺伝子導入は，レンチウイルスベクターなどが必要となるため，この検討は設備及び技術が確立された連携研究者先で行う。
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| Causes of Carryover |
本科研費採択後に分担研究者として参画している外部研究資金が採択された。その外部予算はＨ30年度中に執行する必要があったため，本年度科研費で購入を予定していた物品類をその外部資金を使って購入した。次年度使用が生じた予算は，次年度予算と合算して，機器類の購入に使用する予定である。
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