2020 Fiscal Year Research-status Report
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18K05358
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| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
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Principal Investigator |
坂本 寛 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 教授 (70309748)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平 順一 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 助教 (20549612)
森本 雄祐 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 准教授 (50631777)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ヘム / センサー / プローブ / イメージング / FRET |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Ⅰ．B 蛋白質-蛋白質間相互作用を利用した発光型ヘムセンサー（第3世代）の構築：ヘムが結合したヘムオキシゲナーゼ1（HO-1）と，そのレッドクスパートナーであるNADPH-シトクロムP450還元酵素（CPR）のオープン型コンホメーション固定変異体であるdeltaTGEEの特異的な蛋白質間相互作用を利用した1分子型FRETセンサーのCFP－rHO-1－deltaTGEE－YFPでは，FRETドナーであるHO-1のN端側に位置するシアン色蛍光蛋白質（CFP）からFRETアクセプターであるdeltaTGEEのC端側に位置する黄色蛍光蛋白質（YFP）へのエネルギー移動を想定して設計していた。しかし，CFP－rHO-1－deltaTGEE－YFPのヘム添加実験において，CFPとYFPの蛍光が共に減少することが観測された。このことから，CFPの蛍光エネルギーがHO-1に結合したヘムに吸収されたためにFRETが生じないことが示唆された。そこで，ヘムへのエネルギー吸収を回避するために，蛍光蛋白質の配置を入れ替えたセンサー（YFP－rHO-1－deltaTGEE－CFP）の作製を試みた。また，YFP－HO-1－deltaTGEE－CFPのヘムセンサーとしての機能を評価するため，HO-1とdeltaTGEEを融合せずに，YFP－HO-1とdeltaTGEE－CFPを独立して発現・精製し，ドナーとアクセプターを分離した2分子間センサーの作製を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Ⅰ．B：YFPーHO-1ーdeltaTGEEーCFPを大腸菌BL21に発現させ、Niアフィニティクロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製を試みたが，SDS-PAGEによって目的タンパク質のバンドが確認できなかった。以前精製できたCFPーHO-1ーdeltaTGEEーYFPとの違いは，CFPーHO-1ーdeltaTGEEーYFPでは，アフィニティー精製に利用するHis-tagがC末端にあるのに対し，YFPーHO-1ーdeltaTGEEーCFPでは，発現に用いたpET21bベクターのためにN末端に位置していた。そこで，YFPーHO-1ーdeltaTGEEーCFP/pET21bのHis-tagの挿入位置をN末端からC末端に入れ替え，再度YFPーHO-1ーdeltaTGEEーCFPの発現・精製を試みたところ，SDS-PAGEにより目的タンパク質のバンドが確認できた。現在，センサー機能評価に必要な量のタンパク質を得るため，更に発現・精製を進めている。
一方，2分子間FRETセンサーでは，YFPーHO-1ーdeltaTGEEーCFP/pET21bを鋳型として，YFPーHO-1およびdeltaTGEEーCFPの発現用ベクターを構築し，それぞれのタンパク質を大腸菌にて発現し，YFPーHO-1ーdeltaTGEEーCFPと同様に精製した。SDS-PAGEにより確認したところ，deltaTGEEーCFPは目的タンパク質の分子量（100 kDa）付近にバンドが見られたが，YFPーHO-1では，目的タンパク質の分子量（55 kDa）ではなく，45 kDaに単一のバンドが見られた。得られたYFPーHO-1は黄色を示していることから，YFP部分は発現されており，HO-1部分のC末端側が切断されていると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
Ⅰ．B 1分子型FRETセンサー（YFPーHO-1ーdeltaTGEEーCFP）および2分子型（YFPーHO-1, deltaTGEEーCFP）を用いてヘム添加実験を行い，FRETによる色調変化を観測する。
Ⅱ．B：これまでのヘムセンサーを用いたヘム検出法は，遊離状態のヘムが結合することによる蛍光の消光に焦点を当てていたが，生体サンプル中のヘム検出に関しては，非特異的な結合の存在などにより課題が残る。そこで，生体サンプル中の物質に非特異的に結合した状態で存在するヘムの量を評価するために，センサーの蛍光の回復を用いるヘム検出法の検討を行う。
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| Causes of Carryover |
一昨年度，ホン科研費と他の外部資金で大量の薬品，試薬，消耗品を購入した。昨年度と今年度はそれらを実験に用いたため，物品の購入は予定よりも少なくてすんだ。それに加え，今年度はコロナ禍のため，大学への入構制限があり，研究遂行に想像以上の時間を要することとなったため。また，出張もなくなったため。
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