2022 Fiscal Year Research-status Report
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18K05358
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| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
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Principal Investigator |
坂本 寛 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 教授 (70309748)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平 順一 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 准教授 (20549612)
森本 雄祐 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 准教授 (50631777)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ヘム / センサー / プローブ / FRET |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヘムは生体に必須の色素であり，一部のヘムは細胞内で遊離ヘムとして存在する。遊離ヘムは生体に様々な影響を与えることが知られており，高濃度域では疾患の原因となることが明らかにされている。これまでに，ヘム分解系酵素であるヘムオキシゲナーゼ1（HO1）とNADPHシトクロムP450還元酵素のopen型変異体（ΔTGEE）にそれぞれ緑色蛍光蛋白質の変異体である青色蛍光蛋白質（CFP）と黄色蛍光蛋白質（YFP）を修飾した，蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に基づく一分子型バイオセンサーCFP-HO1-ΔTGEE-YFPを開発した。このセンサーでは，HO1に結合したヘムにCFPの蛍光エネルギーが吸収される可能性があること，蛋白質間相互作用によらないFRETが生じている可能性があること，分子量が大きく可溶化しにくいことが問題であった。今年度は，これらの課題を解決するためにCFPとYFPの修飾位置を交換し，さらにHO1-ΔTGEE間のリンカーを欠損させた二分子型FRETバイオセンサーYFP-HO1/ΔTGEE-CFPを開発することとした。
YFP-HO1およびΔTGEE-CFPをそれぞれ大腸菌発現系を用いて発現・単離した。50 nMのYFP-HO1とΔTGEE-CFPの混合溶液にCFPの励起光（385 nm）を照射し，ヘムを0から75 nMまで添加しながら蛍光スペクトルを測定したところ，YFPの蛍光（525 nm）の上昇が見られ，FRETが観測された。ヘム濃度に対しFRETシグナルの強度変化をプロットした結合曲線より，2.2 nMの解離定数が算出された。また，沈降平衡法を用いた超遠心分析により，ヘム結合型YFP-HO1とΔTGEE-CFPが複合体を形成することが確認された。これらのことより，YFP-HO1とΔTGEE-CFPは，二分子間FRETヘムセンサーとして機能することが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
開発した二分子型FRETバイオセンサーは，分子量が減少したことにより収量が一分子型よりも向上した。また，蛋白質間相互作用によらないFRETも低減された。さらに，励起波長を385 nmとすることでFRETを観察することができ，ヘムをnMオーダーで検出できることが示唆された。しかし，当初予定した一分子型FRETバイオセンサーはその溶解性の低さから安定に発現・精製する方法がまだ確立できていないため。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞内に二分子型FRETバイオセンサーを導入した場合の問題点として，細胞内でのセンサー発現量コントロールが困難であることが考えられる。この課題に対しては，発現比の考慮が必要ない一分子型バイオセンサーの適用が有効であると考えられる。今後，一分子型バイオセンサーの可溶性向上や，HO1-ΔTGEE間のリンカーについて検討を重ね，細胞内導入を目指し研究を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
昨年度までに他の外部資金で大量の薬品，試薬，消耗品を購入した。今年度はそれらを実験に用いたため，物品の購入は予定よりも少なくてすんだ。また，教育高度化本部長として，学内業務に多くの時間を費やした。次年度使用額は，主に実験に必要な消耗品等の購入に充てる。
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