2018 Fiscal Year Research-status Report
チミジンホスホリラーゼ応答型蛍光プローブによる癌細胞特異的イメージング
| Project/Area Number |
18K05360
|
|---|
| Research Institution | Shibaura Institute of Technology |
|---|
Principal Investigator |
幡野 明彦 芝浦工業大学, 工学部, 教授 (10333163)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 血管新生 / 癌診断 / チミジンホスホリラーゼ / 蛍光共鳴エネルギー移動 / 蛍光プローブ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，血管新生因子であるチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）をターゲットとして，ＴＰの酵素活性に応答して蛍光強度が増大するプローブを開発することである。癌細胞が無限増殖を開始すると，ＴＰは血管新生のために過剰発現することが知られている．ＴＰを検出することは，癌の早期過程を発見することに繋がる．今回デザインしたプローブ分子は，チミジンの塩基部位に蛍光団，リボース部位に消光団を導入した分子であり，ＴＰが存在しないときは分子内蛍光共鳴エネルギー移動により蛍光消光している．しかし，ＴＰが存在すると過リン酸分解により塩基部位とリボース部位が切断されて両者の距離が離れることで蛍光強度が増大する．本原理により，血管新生を行っている癌細胞を検出可能にする．
2018年度はプローブのデザインと分子設計，ドッキングシミュレーションを行なった。１）化合物デザイン：デザインした化合物の構造は，チミジンの塩基部位に蛍光色素，リボースの５’位に消光剤を導入した構造であった．合成を行うに当たり，当初のプローブ化合物より消光剤の分子構造を小さくし，酵素との結合を阻害しない形にした。２）ドッキングシミュレーション：デザインした蛍光色素と消光剤を併せ持つプローブ分子がTPと結合することをMFmyPrestoによって評価した．蛍光部位と消光部位を酵素のポケットから外に出す形で，チミジンの基本骨格を酵素ポケット内部に取り込む形で導入される可能性が示唆された．３）プローブ分子の合成：塩基部位に蛍光団クマリン基やダンシル基を導入することに成功した．現在，消光団をリボース部位に導入することを検討中である．しかし，消光団としてのダブシル基は少々大きな置換基なため，導入が困難であった．そこで，ジニトロフェノール基を導入する検討を行っている．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ドッキングシミュレーションによるデザインしたプローブ分子とチミジンホスホリラーゼの結合性は，期待通りの結果となった．ただ，蛍光団と消光団の大きさは，プローブ分子と酵素分子の結合を阻害する可能性が示唆され，プローブ分子の構造は極力小さな分子構造であることが望ましく，適合する化合物の調査を継続していく．また，小さければ良いというだけではなく，観察できる波長帯を持つ蛍光色素でなければ診断薬としては機能しない．そこで，長波長に発光帯があり，かつ分子構造の小さな蛍光性化合物を調査していく．
有機合成は，チミジンの塩基部位にリンカーを介して二種類の蛍光団を導入することが出来た．しかし，リボース側に消光団を導入することがなかなかうまくいっていない．リンカーの長さを変更したり，カップリングの順番を変えることで対応可能と考えている．現在，ダブシル基とジニトロフェノール基を消光団として考えているが，消光剤の分子構造の変更も検討する．
|
| Strategy for Future Research Activity |
プローブ分子の有機化学的合成を最優先に研究を行っていく．同時に，蛍光団と消光団の化合物調査も行っていく．
プローブ分子の合成では，あと１ステップで目的化合物が合成できるところまで来ているが，その最後の１段階がうまくいっていない，カップリングさせるための引き抜き剤（塩基の強弱，t-BuOKやNaHなどの検討）やカップリングの順番を検討する予定である．
チミジンホスホリラーゼによるプローブ分子の応答性評価では，試験管内でプローブ分子の過リン酸分解を受け，蛍光強度が高くなることを高速液体クロマトグラフィー，蛍光分光光度計にて分析を行う．，プローブの濃度と酵素濃度，反応時間などを検討する予定である．
|
| Causes of Carryover |
次年度の酵素実験を行うため，その予算（酵素，緩衝液，遠心エバポレーター）を確保するため．
|
