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2019 Fiscal Year Research-status Report

がん細胞におけるGSTP1の機能解明を目指すGSTP1蛍光プローブ群の創製

Research Project

Project/Area Number 18K05362
Research InstitutionTokyo University of Pharmacy and Life Science

Principal Investigator

藤川 雄太  東京薬科大学, 生命科学部, 助教 (90645144)

Project Period (FY) 2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords蛍光プローブ / GSTP / グルタチオン / 酵素 / 蛍光イメージング / 光誘起電子移動
Outline of Annual Research Achievements

下記(1)~(3)について検討し、いくつかの重要な知見を得ることができた。
(1) 4-ブロモナフタルイミド(BrNaph)をベースとした化合物の創製:初年度に見出したBrNaphのイミド部位誘導体を合成し、中性原子団を付与した化合物は主にGSTP1選択性が保たれることが明らかとなった。N-ヒドロキシルエチル体(HE-BrNaph)を用いて細胞実験を行い、その有用性を示した。またミトコンドリア局在化シグナルTPPを付与したプローブMito-BrNaphを合成した。
(2) メシル基の脂溶性化に基づく化合物の創製: 細胞への投与にプロドラック化不要な化合物を創製するために、Ps-TG中のメシル基をベンジルスルホニル基へ変換したプローブ分子を5種類デザイン・合成した。細胞アッセイによってそのうちの1種類Ps-TG3が高いGSTP1選択性および反応性を示すこと、さらに排出トランスポーター阻害剤MK571を併用することで、蛍光顕微鏡・FACSによって高感度にGSTP1発現細胞を検出できることが示された。また、Ps-TG3の機能性には、分子の程よい脂溶性および高いGSTP1基質性の高さが重要であることが分かった。
(3)長波長型GSTP1プローブの創製: カルボフルオレセインおよびTokyoMagentaに基づいたGSTP1プローブ分子(それぞれPs-CFおよびPs-TM)を合成した。それぞれの化合物はGSH/GSTP1によって、それぞれ40倍および8倍の蛍光強度増大を示した(ともに極大励起波長による励起によって生じる極大蛍光波長での蛍光強度)。特にPs-CFは励起波長を選ぶことで、1波長励起2波長測光型プローブとしてレシオイメージングに適用可能であるという極めて興味深い知見を得た。この蛍光特性はGSTP1プローブのみならず、d-PeT型蛍光プローブの開発に重要な知見であると考えられる。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度GSTP1の基質となる蛍光団の特性評価・反応特性を評価し、当初の計画通り、細胞内局在化プローブの合成を完了した。最終年度に細胞での有用性について検討する予定である。一方で、既存の蛍光団に新たな特性を見出し、レシオメトリックな測定が可能な蛍光プローブを開発することに成功した。この知見は優れた汎用性を秘めており、GSTP1プローブのみならず新たな蛍光プローブの作動原理として有用であると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度(最終年度)は主にこれまで開発した蛍光プローブの生物応用(1ならびに2)およびGSTP1活性検出以外に対しても汎用的なプローブデザイン(3)について可能性を模索する。
(1)ミトコンドリア局在型GSTプローブMito-BrNaphの応用:平成31年度には3種類のMito-BrNaphを合成した。そこで令和2年度は、まずは別途用意したミトコンドリア標的化GSTP1安定発現細胞株MCF7/mitoGSTP1(既に樹立済み)に対してこれらのプローブを適用し、特異性などを評価する。次に、内在的にGSTP1が発現している細胞に対して本プローブを適用し、本プローブが汎用的に機能するかどうかを検証する。(2)平成31年度に見出したレシオ型蛍光プローブの生物応用を行う:我々はこれまでの研究において、上皮由来増殖因子EGFで細胞を刺激すると、GSTP1蛍光プローブの蛍光強度が大きく低下するという現象を見出している。そこで、この原因が細胞内へのプローブ流入の抑制なのかGSTP1活性の抑制によるものなのかを、レシオ型プローブを利用することによって明らかにする。また、Raji細胞にデシタビン処理を施すことによって生じるGSTP1発現を検出することで、本プローブの有用性を示す。(3) BrNaphイミド側鎖の違いによる蛍光プローブの排出に対する影響の精査: BrNaphは側鎖に様々な修飾を加えることで比較的思いの特性を付与することができる。そこでこの特性を活かし、グルタチオン化されても細胞外へ排出されない蛍光プローブのデザイン・合成を行う。GSTP1プローブ以外にも応用できる汎用的なデザインによる化合物を合成・評価し、細胞レベルにおいて検証する。

Causes of Carryover

新型コロナウイルスにより、出席予定であった学会が取りやめになったことにより旅費が不要になったため。

  • Research Products

    (17 results)

All 2020 2019

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (15 results)

  • [Journal Article] A highly selective fluorogenic substrate for imaging glutathione S-transferase P1: development, cellular applicability to epigenetic studies2019

    • Author(s)
      Mori, M., Fujikawa, Y., Kikkawa, M., Shino, M., Sawane, M., Sato, S. and Inoue, H.
    • Journal Title

      Chemical communications

      Volume: 55 Pages: 8122-8125

    • DOI

      10.1039/c9cc03064f

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 4-Bromo-1,8-naphthalimide derivatives as fluorogenic substrates for live cell imaging of glutathione S-transferase (GST) activity.2019

    • Author(s)
      Fujikawa, Y., Terakado, K., Nampo, T., Mori, M., and Inoue, H.
    • Journal Title

      Talanta

      Volume: 204 Pages: 633-640

    • DOI

      10.1016/j.talanta.2019.06.059

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] GSTP1選択的活性検出蛍光プローブの開発とその応用2020

    • Author(s)
      森 雅矢,藤川 雄太,井上 英史
    • Organizer
      日本化学会第100春季年会
  • [Presentation] D-アミノ酸オキシダーゼを用いたミトコンドリア H 2O 2 産生系の構築とその応用2020

    • Author(s)
      池谷 知美、藤川 雄太、熊倉 夏希、井上 英史
    • Organizer
      日本薬学会第100年会
  • [Presentation] プロドラッグ化に依らない細胞膜透過型GSTP1活性検出蛍光プローブの開発とその応用2020

    • Author(s)
      渡邉 幸大、藤川 雄太、森 雅矢、坂田 萌、井上 英史
    • Organizer
      日本薬学会第100年会
  • [Presentation] 森 雅矢、藤川 雄太、井上 英史2020

    • Author(s)
      GSTP1選択的活性検出蛍光プローブ群の開発とその応用
    • Organizer
      日本薬学会第100年会
  • [Presentation] 海外留学のススメ~海外での挑戦から考えること~2020

    • Author(s)
      藤川 雄太、中山 淳
    • Organizer
      日本薬学会第100年会
  • [Presentation] D-アミノ酸酸化酵素/D-アミノ酸ペアによるミトコンドリア局在型H2O2産生系の構築とその応用2019

    • Author(s)
      藤川 雄太,熊倉 夏希,青山芙由子,田村 瑞希,井上 英史
    • Organizer
      第72回日本酸化ストレス学会学術集会
  • [Presentation] 新規GSTP1選択的活性検出蛍光プローブの開発2019

    • Author(s)
      森 雅矢、藤川 雄太、井上 英史
    • Organizer
      第8回医薬工3大学包括連携推進シンポジウム
  • [Presentation] ミトコンドリア局在型H2O2産生系の構築と応用2019

    • Author(s)
      藤川 雄太、 熊倉 夏希、池谷 知美、青山 芙由子、田邨 瑞希、井上 英史
    • Organizer
      第8回医薬工3大学包括連携推進シンポジウム
  • [Presentation] 高い選択性を持つ細胞膜透過型GSTP1活性検出蛍光プローブの開発2019

    • Author(s)
      渡邉 幸大、藤川 雄太、森 雅矢、井上 英史
    • Organizer
      第63回日本薬学会関東支部大会
  • [Presentation] 脱ユビキチン化酵素UCH-L1は低酸素条件下でTGF-βシグナルを増強する2019

    • Author(s)
      永田 麻未、佐粧 彩海、鈴木 理子、鈴木 映里、下田 裕太、藤川 雄太、渡部 琢也、伊東 史子、井上 英史
    • Organizer
      第92回日本生化学会大会
  • [Presentation] 脱ユビキチン化酵素UCH-L1はTGF-bシグナルを増強し、肺がん形成に関与する2019

    • Author(s)
      永田麻未、伊東史子、藤川雄太、井上英史
    • Organizer
      第78回日本癌学会学術総会
  • [Presentation] GSTP1選択的活性検出蛍光プローブの開発とがん細胞イメージング2019

    • Author(s)
      森雅矢、藤川雄太、井上英史
    • Organizer
      第78回日本癌学会学術総会
  • [Presentation] 蛍光プローブを利用したスクリーニング系に基づく生細胞 GSTP1 選択的阻害剤の開発2019

    • Author(s)
      藤川雄太,南保泰希,今村理世,岡部隆義,小祝孝太郎,千田拓哉,井上英史
    • Organizer
      第37回メディシナルケミストリーシンポジウム
  • [Presentation] 赤色酵母由来D-アミノ酸オキシダーゼを利用したミトコンドリアH2O2産生系の構築およびその応用2019

    • Author(s)
      池谷 知美、熊倉 夏希、藤川 雄太、井上 英史
    • Organizer
      第11回大学コンソーシアム八王子学生発表会
  • [Presentation] GSTP1選択的活性検出蛍光プローブの開発とその応用2019

    • Author(s)
      森 雅矢、藤川 雄太、井上 英史
    • Organizer
      第11回大学コンソーシアム八王子学生発表会

URL: 

Published: 2021-03-11  

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