植物プロテアーゼによるマメ科根粒のエイジング機構の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05381
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 下田 宜司 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (80415455)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 箱山 雅生 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 研究員 (60422804)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 根粒共生 / マメ科植物 / プロテアーゼ

Outline of Annual Research Achievements

昨年度に引き続き、ミヤコグサの根粒特異的なアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子を過剰発現する形質転換ミヤコグサのT2世代系統の窒素固定活性の評価を実施した。その結果、高濃度の窒素処理によって根粒の老化を誘導した場合や自然老化根粒においては、アスパラギン酸プロテアーゼの過剰発現による窒素固定活性の明確な上昇は認められなかった。
根粒の老化時にアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子を過剰発現するため、老化根粒で高い発現を示す４種類のシステインプロテアーゼ遺伝子のプロモーター活性をGUSレポーターアッセイにより調査した。その結果、暗所処理により老化した根粒、およびnifH遺伝子を欠損した根粒菌によって形成した老化根粒の内部において明確な活性が認められた。しかしながら、いずれのシステインプロテアーゼ遺伝子においても、老化の有無にかかわらず、根の中心柱において非常に強いGUS活性が認められたことから、発現する組織の特異性に問題があることが明らかとなった。
窒素固定に異常をきたすミヤコグサ変異体を用いたRNA-seq解析のデータから、根粒老化時に発現誘導されるシステインプロテアーゼ遺伝子と共発現する遺伝子として2つのホメオボックス転写因子を同定した。これらの転写因子はいずれも、RNA-seq解析に用いたのとは別の窒素固定不全変異体の根粒においても発現が誘導されることが分かった。一方で、２つのホメオボッスク転写因子のミヤコグサホモログ（４遺伝子）は窒素固定不全変異体の根粒では発現誘導されないことが分かった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

老化根粒で発現する遺伝子のプロモーターを用いてアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子の過剰発現を実施する予定だったが、プロモーターの組織特異性の問題により予定通りに進まなかったため。

Strategy for Future Research Activity

過剰発現に使用するプロモーターの長さを変え、組織特異性を再度調査する。共発現解析により同定した2つのホメオボックス転写因子について、根粒プロテアーゼ遺伝子の発現への関与を明らかにする。

Causes of Carryover

ミヤコグサの形質転換等の実験が一部計画より遅れたことと、新たに同定した転写因子の解析を次年度に実施する必要が生じたため、未使用額が生じた。これらの予算は次年度に転写因子の機能解析等に使用する。