2020 Fiscal Year Annual Research Report
Carbohydrate conversion by novel bacterial carbohydrate epimerases
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18K05382
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
佐分利 亘 北海道大学, 農学研究院, 准教授 (00598089)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | マンノース2-エピメラーゼ / セロビオース2-エピメラーゼ / マンノース / タロース |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糖質は構造多様性に優れ，様々な優良な機能をもつことが知られている。一方，自然界に豊富な糖質は限定的であるため，新しい糖質の応用の開拓には豊富な糖質を希少糖質へと変換する技術の開発が必要である。本研究では，グルコースからマンノースへの一段階異性化反応を触媒するマンノース2-エピメラーゼ (ME) について機能・構造を解明すること，ホモログの機能解析を通じて新たな単糖変換酵素を取得することを目的とした。本年度は，昨年度構築した変異酵素のハイスループットスクリーニング系を利用してRunella slithformis由来MEの高活性化変異酵素のスクリーニングを実施した。ホモログタンパク質との配列比較により，保存性が低いアミノ酸残基17残基を対象として，飽和変異を導入した．各アミノ酸残基に対する飽和変異ライブラリーの酵素活性を測定し，野生型酵素の1.5倍の比活性を示す変異酵素P233Kを取得した。P233Kのマンノースに対する速度パラメータを測定すると，本変異酵素のKm値は野生型酵素の1/2程度であり，P233K変異によりミカエリス複合体が安定化したことが示唆された。
単糖にも有意に高いエピメリ化活性を持つMelioribacter roseus由来セロビオース2-エピメラーゼ (CE) については，ガラクトースに対する活性を利用してタロースの合成を行った。400 g/Lガラクトースを基質とした反応により，50 g/Lタロースの生成が認められた。この反応では、イソメラーゼ反応生成物であるタガトースの生成も見られた。この反応液をカルシウム配位型イオン交換樹脂を用いたクロマト分画に供し，純度92%のタロースを547 mg得た。以上より、本酵素はタロース生産に実質的に利用できることが明らかになった。
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