ゲノム編集技術が拓く遠赤色光をも利用できる特異な非モデル藍藻研究の新展開

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05389
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 土屋 徹 京都大学, 人間・環境学研究科, 准教授 (20362569)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: シアノバクテリア / クロロフィルd / 光合成 / 遠赤色光 / ゲノム編集

Outline of Annual Research Achievements

昨年度までに開発に成功したAcaryochloris marinaでのゲノム編集関連技術について、特にCRISPR干渉を中心にさらに研究を進めた。これまでに、多くのバクテリアで保持されることが知られている広宿主域プラスミド由来のベクターを用いて、ヌクレアーゼからDNase活性を除いた変異体タンパク質の遺伝子、ヌクレアーゼ変異体を標的配列に導くガイドRNAの発現カセットを導入することで、光合成での光捕集に機能するアンテナタンパク質であるフィコシアニンの遺伝子を標的としたA. marinaのCRISPR干渉に成功していた。しかし、標的遺伝子によっては発現量が異なることや、表現型が見いだせる遺伝子発現抑制の程度が一様ではないことから、一つのベクターが全ての標的遺伝子の解析に有効であるとは限らない。そこで、フィコシアニン遺伝子以外の遺伝子を標的としたCRISPR干渉を試みつつ、CRISPR干渉ベクターの改変を進めた。その結果、作製した一連のベクターを利用することで、CRISPR干渉による遺伝子発現抑制のより詳細な制御が可能となった。ゲノム編集による遺伝子破壊株の単離と比較するとCRISPR干渉による遺伝子発現抑制株の方が作製しやすいことから、はじめにCRISPR干渉をおこない表現型が現れた標的遺伝子については、さらにゲノム編集をおこなうという方針で研究を進めた。増殖の速いモデルシアノバクテリアより解析までの時間はかかるものの、これらの成果はA. marinaを対象とした逆遺伝学による網羅的な遺伝子機能の解析における技術的基盤が整ったことを示している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、Acaryochloris marinaでのCRISPR干渉の至適化に成功したという大きな進展が見られた。CRISPR干渉による遺伝子発現抑制では、標的遺伝子により抑制の程度を制御しなければならない。本年度作製した一連のベクターにより、きめ細やかな遺伝子発現抑制の条件検討が可能となった。これは、適したベクターを選択することで、多くの標的遺伝子対してCRISPR干渉による遺伝子発現抑制に依存した表現型を見いだせることが可能になったことを意味する。
以上を鑑みて、現在までの達成度は「おおむね順調に進展している」とした。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究では、CRISPR干渉を駆使した研究に注力する。具体的には、光合成関連遺伝子などを標的とした逆遺伝学的解析をおこない、その機能の解明を目指す。CRISPR干渉による遺伝子発現抑制で表現型が見いだされた遺伝子ついては、ゲノム編集による遺伝子破壊を試みる。このように、CRISPR干渉とゲノム編集により、Acaryochloris marinaでの網羅的な逆遺伝学的解析を進める。

Causes of Carryover

本年度も、新型コロナウイルスの影響による研究活動の低下が著しかった。その結果、当初の計画から進展が遅れてしまったため、未使用額が生じることになった。