2018 Fiscal Year Research-status Report
Properties of novel microorganisms and enzymes involvedin marine polysaccharide degradation for utilizing marine biomass
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18K05392
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
大城 隆 鳥取大学, 工学研究科, 教授 (00233106)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
八木 寿梓 鳥取大学, 工学研究科, 准教授 (10432494)
鈴木 宏和 鳥取大学, 工学研究科, 准教授 (80462696)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 海藻多糖分解酵素 / フコイダン / アルギン酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、新規多糖分解酵素に関する検討、具体的にはフコイダン分解酵素ならびにアルギン酸分解酵素に関する研究を実施した。
フコイダン分解酵素に関しては、海藻から単離したオキナワモズク由来フコイダン資化性微生物、Luteolibacter algae H18 から脱アセチル化したフコイダンを低分子化する酵素を精製し、N末端アミノ酸配列を決定した。H18 株のドラフトゲノム解析を基に、本酵素タンパク質をコードする遺伝子を同定した。この遺伝子をクローニングし、大腸菌で異種発現することができ、酵素活性を確認した。組み換え大腸菌から酵素を均一に精製し、諸性質を検討したところ、本酵素はオキナワモズク以外の海藻由来のフコイダンには作用しないこと、脱アセチル化していないオキナワモズクフコイダンにも作用することが明らかになった。また、本酵素は既知のフコイダン分解酵素と比較すると、アミノ酸配列の相同性は低く、新規酵素である可能性が高いと考えられた。
アルギン酸分解酵素に関しては、海水から単離したアルギン酸資化性微生物、 Shewanella sp. YH1 からアルギン酸リアーゼ（AlgSI-PL7）を精製し、N末端アミノ酸配列を決定した。YH1 株のドラフトゲノム解析を基に、本酵素タンパク質をコードする遺伝子を同定した。この遺伝子をクローニングし、大腸菌で異種発現することができ、酵素活性を確認した。組み換え大腸菌から酵素を均一に精製し、諸性質を検討したところ、本酵素は40℃処理で凝集するものの、60℃では活性を保持するという奇妙な特性を保持していた。また本菌株のゲノム情報を基に、先と異なるアルギン酸リアーゼ遺伝子を大腸菌で発現したところ、この酵素（AlgSV1-PL7）は30℃で放置しても20日間活性が80％保持され、アルギン酸を出発基質として単糖を生成できることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
フコイダン低分子化酵素については、生産菌株であるLuteolibacter algae H18 はフコイダンを単一炭素源しなければ分解酵素を生産せず、生育も最大 OD=1 程度と低いため、この野生株からの酵素精製は困難を極めると想定していた。しかしながら、大量の培養液からの酵素精製を行うことにより、精製酵素を得ることができた。目的遺伝子を同定し、異種発現を試みた際、酵素のサブユニット分子量が 100万と非常に大きかったものの、通常の方法で大腸菌で生産することができ、酵素化学的諸性質を決定するに至った。さらに、本酵素が既知のフコイダン分解酵素と低い相同性しか示さないことが明らかになり、本酵素の新規性を提唱することができた。
アルギン酸分解酵素については、フコイダン分解酵素と異なり、今までに数多くの研究例があるものの、今回新たに単離した Shewanella sp. YH1 から2種類のアルギン酸リアーゼを精製することができた。そして、これらの酵素の一方（AlgSI-PL7）には、特異な凝集特性が、もう一方（AlgSV1-PL7）には、長期の保存安定性とアルギン酸を単糖にまで分解できる特性が備わっていることを見出すことができた。特に、AlgSV1-PL7は産業用酵素としての利用価値があるものと思われた。
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| Strategy for Future Research Activity |
フコイダン低分子化酵素をコードする遺伝子周辺にはフコイダン分解に係る脱硫酸化酵素等が局在する可能性が高く、これら遺伝子の異種発現および酵素の諸性質検討も実施していく。また、酵素的に調製した脱アセチル化フコイダン、ならびに低分子量脱アセチル化フコイダンについて硫酸基が保持されていることを確認したうえで、これら標品のアミロイド線維形成抑制効果について、インシュリンやリゾチームをモデル蛋白質として検証する。成果が見られた場合、鳥取大学医学部で作成されたアルツハイマー病モデルマウスを用いた予防効果、病理組織解析を行う予定である。一方、好熱性海藻分解菌に関しては、海藻バイオリファイナリーの構築を目標に、好熱性多糖分解菌のさらなる検索と特性解明を目指す。
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| Causes of Carryover |
遺伝子工学実験、蛋白質化学的実験が想定よりうまく進み、消耗品の支出を抑えることができた。遺伝子発現実験について、ターゲット遺伝子を増やす、あるいは高価な試薬を購入し、さまざまなアプローチを試みる予定である。
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