2019 Fiscal Year Research-status Report
Properties of novel microorganisms and enzymes involvedin marine polysaccharide degradation for utilizing marine biomass
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18K05392
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
大城 隆 鳥取大学, 工学研究科, 教授 (00233106)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
八木 寿梓 鳥取大学, 工学研究科, 准教授 (10432494)
鈴木 宏和 鳥取大学, 工学研究科, 准教授 (80462696)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 海藻多糖分解酵素 / フコイダン / アミロイド / 脱硫酸化酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オキナワモズクフコイダン分解菌、Luteolibacter algae H18 をフコイダンを単一炭素源とする合成培地で数10リットル培養し、得られた菌体から、3段階のカラムクロマトグラフィーによりフコイダン脱硫酸化酵素の精製を行った。N末端アミノ酸配列を決定し、H18株のゲノム情報を基に、精製タンパク質とほぼ同じ分子量のタンパク質をコードする遺伝子を同定した。この遺伝子をクローニングし、大腸菌で異種発現し、酵素活性を確認した。本酵素は、オキナワモズク以外のフコイダンに対して脱硫酸化活性を示さず、そのアミノ酸配列は、既知のフコイダン脱硫酸化酵素とは全く異なっており、新規酵素であると思われた。
オキナワモズクフコイダンおよび、それを脱アセチル化あるいは低分子化したフコイダンを調製し、アミロイド線維形成抑制効果を評価した。モデルタンパク質としてインシュリンを用い、塩酸グアニジンを添加してアミロイド線維形成を促進させる条件下で、チオフラビンTの蛍光上昇抑制を指標に評価したところ、上記3つのいずれのフコイダンにもアミロイド線維形成抑制効果が認められた。しかし、他の海藻多糖であるアルギン酸やカラギーナンでは効果は見られなかった。
海藻分解性好熱菌として当研究室で分離した、Geobacillus thermodentrificans OS27 株について、ゲノム情報から糖加水分解酵素としてあまり報告例のない2種のタイプの遺伝子を選択し、これらの発現産物について諸性質を解析した。その結果、一方はエキソ型キシロシダーゼ、もう一方はエキソ型アラビノシダーゼ活性を示した。後者の活性を示す酵素はほとんど報告されておらず、さらに、アラビノースの転位活性も認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
フコイダン脱硫酸化酵素を野生株 Luteolibacter algae H18 から夾雑タンパク質の残存は認められたものの、高度に精製でき、N末端アミノ酸配列を決定できたことにより遺伝子クローニング、異種発現を達成するに至った。この酵素は新規酵素である可能性が高く、酵素化学的諸性質について解明していく予定である。
フコイダンによるアミロイド形成抑制効果が認められたことから、フコイダンの新たな生理活性を示すための基礎データが得られたと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
オキナワモズクフコイダンに関与する酵素を本研究では、脱アセチル化酵素、低分子化酵素、脱硫酸化酵素の３つについて明らかにすることができた。このように一つの菌株からフコイダン分解に関する複数の酵素が解明された例はない。しかし、これらの酵素を混合しても単糖、オリゴ糖レベルまでの分解は起こっていない。一般的に多糖分解の最終段階はエキソ型酵素が触媒することから、ゲノム情報からさらなる低分子化に関与する遺伝子を検索していく。
また、オキナワモズクフコイダンを分解可能な別の菌株も単離できたので、この菌株が有するフコイダン分解酵素系についても検討を行う。
アミロイド線維形成阻害については、オキナワモズク以外のフコイダンについて同様の評価を行い、その有用性についてデータを得る。
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| Causes of Carryover |
遺伝子工学実験、蛋白質科学的実験が想定より順調に進み、消耗品の支出を抑えることができた。今後、対象とする遺伝子を増やす予定であるため、遺伝子工学用試薬の購入額が増加する見込みである。また、様々な化合物に対する反応性を検討するため、高価な試薬の購入も想定している。
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