2018 Fiscal Year Research-status Report
輸送基質による酵母アミノ酸輸送体の動的構造変化と自己分解シグナルの伝達
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18K05397
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| Research Institution | Aoyama Gakuin University |
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Principal Investigator |
阿部 文快 青山学院大学, 理工学部, 教授 (30360746)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 出芽酵母 / アミノ酸輸送体 / トリプトファン輸送体Tat2 / ユビキチン依存性分解 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、細胞内アミノ酸濃度の恒常性を維持する機構の解明を目的とし、特に出芽酵母のトリプトファン輸送体Tat2に着目して研究を行った。Tat2は芳香族アミノ酸を基質とする高親和性の輸送体であり、高濃度（40 ug/mL）トリプトファンの存在下では不要となるため、合成後、細胞膜に到達する前に液胞で分解される。一方、低濃度（4 ug/mL）トリプトファンの存在下では効率良く細胞膜へと運ばれる。しかしながら、既に細胞膜上に存在するTat2が、培地のトリプトファン濃度に応じて分解が促進されるのか否かは不明だった。そこで今年度は、ガラクトース誘導性プロモーターの下流にTAT2を連結し、グルコース投与で転写抑制すると同時にトリプトファンを投与し、Tat2の分解を追跡した。このとき、Tat2に様々な変異を導入することで、基質誘導による分解に必要なアミノ酸残基を特定した。その結果、高濃度トリプトファン投与によってTat2は30～60分で分解されることがわかった。100種以上の変異型Tat2の分解を調べたところ、D74R（細胞質末端変異）のように輸送活性はあるが分解遅延するもの、E286A（TMD6内の変異）のように輸送活性を欠き分解遅延するもの、そしてV326L（TMD7内の変異）のように輸送活性を欠き、低濃度トリプトファン条件下でも恒常的に分解促進されるものに分類された。興味深いことにD74R-V326L二重変異型Tat2では輸送活性が回復したことから、V326L変異による何らかの構造異常がTat2に生じ、ユビキチン分解の標的になったものと考えられる。
一方、I285TやI285V変異によりTat2は超高活性型に転じ、1 ug/mL程度のトリプトファン存在下でも良好に増殖した。生化学的解析によって、これは変異によるKm値の低下とVmaxの増大による相乗効果であることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Tat2の100種類以上の変異型について分解パターンを全て調べ、輸送活性との関連性を示唆することができた。今後Tat2の構造転移と分解との関連を解明する前提となる十分な材料が得られたことから、研究は概ね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
各種変異型Tat2には何らかの構造異常が生じており、結果としてRsp5ユビキチンリガーゼの標的となったものと考えられる。しかしながら、遺伝学的解析ではこうした構造的実体を解明することはできない。そこで、細胞膜から可溶化したTat2を非変性ゲル電気泳動で分離し、野生型と比較する。予備的な実験から、野生型Tat2は単量体または二量体として細胞膜上で存在し、非変性ゲル電気泳動では2本のバンドとして検出されている。変異による構造異常が、非変性ゲルを用いたTat2の電気泳動パターンに違いをもたらすものと期待しこれを解析する。また、高濃度トリプトファンが細胞に投与されたとき、Rsp5アダプタータンパク質であるBul1が野生型Tat2を認識し、Rsp5依存的な分解を誘導する。そこで、低トリプトファン培地で恒常的に分解される変異型Tat2の分解も、やはりBul1に依存するのかどうかについて解析を行う。
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| Causes of Carryover |
バイオシェーカーBR-42FLの購入を当初予定していたが、培養のスケールダウンをはかったため、今年度は現有するシェイカーでまかなうことができた。一方、次年度はDNAのシークエンスが多数見込まれることから、繰り越し予算によってこれをまかなう方針である。
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