2020 Fiscal Year Research-status Report
放線菌門がもつタンデム型ABCトランスポーターの構造機能と生理的意義の解明
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18K05398
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
矢嶋 俊介 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (90301548)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | X線結晶構造解析 / 基質認識 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ABCトランスポーターは細菌からヒトに至るまですべての生物において存在し、糖、アミノ酸、微量化合物などの細胞への出入りという基本的な生理機能を担う重要な役割を果たしている。申請者はMicrobacterium hydrocarbonoxydansのヒドラジド分解を担うオペロン中に、ジペプチドトランスポーターとアノテーションされる蛋白質と、新たな構造を有する可能性をもつABCトランスポーターの2種類の遺伝子が並んでいることを見いだした。また、このタンデムに存在するトランスポーターは放線菌門に広く存在することが示唆された。非天然化合物のヒドラジドを輸送できると考えられることから、本研究では、トランスポーターの立体構造、機能解析を中心に、この新規オペロンにコードされる蛋白質の生理機能上の重要性解明を目的として研究を進めている。
今年度はその中で、オペロン中に存在する２種類のトランスポーターのうち、特に膜貫通サブユニットとATPaseサブユニットが融合したトランスポーターの輸送活性を測定することを試みた。これは、この融合型のトランスポーターが既知のトランスポーター、インポーターのどちらの機能を有するのか、アミノ酸配列からでは特定できなかったことによる。大腸菌を用いた組換え体蛋白質の他に、in vitro翻訳系を用いた目的タンパク質の調製を行った。結果、in vitro翻訳系を用いることで、直接リポソーム中にタンパク質を組み込むことができた。これらを用いてATPase活性を指標として輸送アッセイ系の構築を試みた。各種条件を検討したが、まだトランスポーター活性の検出には至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
コロナ禍により、2020年度前半は入構禁止措置、後半も時間制限などが取られたため、研究に供する時間が十分に得られず、進捗はやや遅れている。より効率的なタンパク質発現系の構築、トランスポーター輸送活性測定、結晶構造解析などの条件検討を十分行うことが難しい状況であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も当初の計画に沿って、トランスポーターの機能、構造解析を進める。トランスポーターの輸送活性測定、またX線結晶構造解析による構造解析である。輸送活性については、in vitro 翻訳系、大腸菌組換え体の両面からアプローチする。GFPを融合させたタンパク質も構築しており、発現した蛋白質の発現量やフォールディングの状況を可視化しながら条件検討が可能である。蛋白質の結晶化のために、より多くの目的タンパク質を発現できるように発現系の改良を引き続き行っていく。
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| Causes of Carryover |
2020年度はコロナ禍の影響で研究に供する時間が非常に制限されたため、次年度使用額を生じることとなった。その費用は、当初予定していた研究のために使用する。
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Research Products
(1 results)
