2018 Fiscal Year Research-status Report

ワクチンアジュバントとしての糖鎖改変酵母の粘膜免疫増強効果とその作用機序の解明

Research Project

Project/Area Number	18K05404
Research Institution	National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
Principal Investigator	安部博子国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (40363220)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	酵母 / 糖鎖改変 / アジュバント
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、出芽酵母の細胞壁構成成分の組成、及び構造が変化する変異株を利用して、アジュバントとしての効果が最も高い変異株を見出し、その作用機序について明らかにすることを目的とする。これまでに、我々が取得している様々な細胞壁組成を持つ糖鎖改変出芽酵母群の中から酵母型糖鎖（外糖鎖）除去株TIY20(och1 mnn1 mnn4 破壊株:マンノース8個のN-結合型糖鎖を持つ（M8）)及び本株に変異処理を施し増殖能および高温度感受性を回復させた株についてマクロファージ活性化能および骨髄由来樹状細胞活性化能についての解析を行った。出芽酵母の野生型株であるW303-1B、TIY20株、その変異株YAB100、101、102、103、C9、C19株から細胞壁を単離し、マウスマクロファージ様培養細胞RAW-Blue細胞に添加した。RAW-Blue細胞はTLR2およびDectin-1などのレセプターの活性化をレポーター遺伝子（分泌型アルカリフォスファターゼ　（ＳＥＡＰ））の発現を調べることにより容易に評価することができる。また、マウス骨髄から回収した細胞をGM-CSFとB-ME入り培地で培養することにより分化させた骨髄由来樹状細胞(BMDC)に上記と同様の細胞壁を添加した際のサイトカイン誘導能について調べた。その結果、RAW-Blue細胞のSEAP誘導活性は糖鎖改変酵母では野生型酵母とほぼ同様の活性を示し、糖鎖の違いによる活性の差は確認できなかった。一方、BMDCにおいては糖鎖改変酵母で高いサイトカイン誘導活性が確認できた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason これまでに、我々が取得している様々な細胞壁組成を持つ糖鎖改変出芽酵母群の中から酵母型糖鎖（外糖鎖）除去株TIY20(och1 mnn1 mnn4 破壊株:マンノース8個のN-結合型糖鎖を持つ（M8）)及び本株に変異処理を施し増殖能および高温度感受性を回復させた株についてマクロファージ活性化能および　骨髄由来樹状細胞活性化能についての解析を行うことができた。マクロファージに加え、BMDCでのスクリーニングも加えることによって、高い免疫誘導活性をもつ糖鎖改変酵母のスクリーニングが順調にすすんでいる。また、脾臓通常型樹状細胞(cDC)における活性についての検討も開始できている。
Strategy for Future Research Activity	樹状細胞はRaldh2を発現しレチノイン酸合成能を持つことによって、抗原特異的なIgA抗体の誘導能が備わることがすでに分かっている。そこで、本来はRaldh2を発現しない脾臓由来cDCに糖鎖改変酵母株の細胞壁成分を添加することによって刺激を行い、Raldh2mRNAの発現を効率よく誘導する酵母株を探索する。Raldh2はDectin-1の刺激によって発現誘導されることが分かっている。より効率的なRaldh2の発現誘導のためにDectin-1自体の発現量も増加させる必要がある。そこで、Dectin-1の発現上昇活性を示す酵母株のスクリーニングも合わせて行う。スクリーニングされた酵母株が実際に抗原特異的IgAおよびIgG誘導能があるのかについて調べる。アジュバントとして細胞壁成分、抗原としてOVAを混合し、マウスの筋肉中に投与を行う。3週間後に、血清中の抗原特異的IgGおよび糞便中のIgAの量を測定する。また、抗原の追加投与による効果についても調べる。追加投与の際には、経口および経鼻両方についての効果も調べる。
Causes of Carryover	実験補助員の雇用が間に合わずに人件費を使用していないことに加え、物品費用について研究室保有の共通試薬や物品を使用することができ新規に購入する消耗品類が少なかったため。今年度は動物実験を実施するとともに高額なキット類、試薬、消耗品等を新規に購入するため消耗品類等で使用できる。