2019 Fiscal Year Research-status Report
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18K05409
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
池田 正人 信州大学, 学術研究院農学系, 教授 (00377649)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹野 誠記 信州大学, 学術研究院農学系, 准教授 (30422702)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | コリネバクテリウム グルタミカム / 中鎖脂肪酸 / 脂肪酸合成酵素 / アシル-CoA チオエステラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【中鎖生産の戦略1：脂肪酸合成酵素Fasの改変】コリネ菌の長鎖生産菌に、脂肪酸合成酵素FasAの鎖長伸長を担うケトアシルシンターゼ（KS）ドメイン内変異（Thr2563Ile）を導入すると、長鎖の代わりに中鎖を生成するが、その生成量はごく微量で、長鎖から中鎖への発酵転換は成立していない。原因は、中鎖CoA体の脱CoA化を担うチオエステラーゼ（Tes）反応がネックになっているためと推察。中鎖にも対応するとの示唆がある大腸菌由来tes（E-tesA、E-tesB、E-ybaW の3種）を発現させると、特にE-tesA導入株で中鎖が増加傾向を示し仮説の妥当性が検証された。
【戦略2：枯草菌BioI酵素の利用】BioIはコリネ菌内で作動し、長鎖のアシルCoAを開裂してC7のジカルボン酸であるピメリン酸（CoA体）を生成する（既報）。その過程で副生する中鎖脂肪酸をGC-MS分析。意外にもC9（ペラルゴン酸）のみが蓄積。生成量はピメリン酸と等モル。本結果は、BioIが、コリネ菌の主要なオレオイル-CoA（C18:1Δ9）を基質とせず、副次的なパルミトイル-CoA（C16:0）のみを基質としていることを示す。一方、フィード実験で、本菌種が元来合成できないパルミトレオイル-CoA（C16:1Δ9）はより良好な基質になることを見いだす。
【戦略3：リポ酸の炭素骨格C8の供給ルートの解明と利用】リポ酸の炭素骨格（C8の中鎖オクタノイルCoA）がFasBで合成されていることを見いだすも、その破壊株がオクタン酸（C8）の完全要求性にならない（リーキー形質）ことから、別のバイパスが潜むと推察（既報）。「長鎖脂肪酸→オクタン酸への開裂→オクタノイルCoAへのCoA化」と2段階で進むルートを想定。FasB破壊株ベースで、後段のCoA化反応の候補となる4種のアシル-CoAシンセターゼ（FadD）を全て破壊したが、リーキー形質に変化なし。従って、バイパスはオクタン酸経由でなく、オクタノイルCoAを直接生成するルートと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の研究実施計画では以下の3点を掲げた。1と2の項目は、ほぼ計画通りに実施して、今後の課題と方向性を明確にできたと判断できるため。3の項目は当初の仮説が成り立たないことが示唆されたため、仮説を見直してその検証を進めている。
１．中鎖生産の戦略1：脂肪酸合成酵素Fasの改変
２．中鎖生産の戦略2：枯草菌BioI酵素の利用
３．中鎖生産の戦略3：リポ酸の炭素骨格C8の供給ルートの解明と利用
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| Strategy for Future Research Activity |
【中鎖生産の戦略1：脂肪酸合成酵素Fasの改変】これまでの検討で、長鎖から中鎖への発酵転換には、脂肪酸合成酵素FasAの改変だけでは不十分で、中鎖CoA体の脱CoA化を担う中鎖型チオエステラーゼの発現も必要なことが示唆。その候補として、コリネ菌ゲノムにあるtesホモログ（tesBとCgl2586）の増幅効果を検討する。併行して、長鎖型Tesを中鎖型に改変できないかも検討予定。目的変異体の簡便な選択法として、中鎖（代表としてC8のオクタン酸）を検出できるバイオアッセイ系の開発を試みる。
【戦略2：枯草菌BioI酵素の利用】本戦略では、長鎖（CoA体）を開裂して中鎖を生成するBioI反応の改善が不可欠である。BioIの質的/量的改変を試みる一方で、BioI反応に適した基質[パルミトイル-CoA（C16:0）またはパルミトレオイル-CoA（C16:1Δ9）]を優勢合成できる宿主の開発を試みる。
【戦略3：リポ酸の炭素骨格C8の供給ルートの解明と利用】C8供給に関わるバイパス経路の欠損株の誘導を試みる。具体的には、オクタン酸リーキー性を示すFasB破壊株から完全要求株を選択する。その原因変異を特定する方法でバイパス経路を特定する。
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| Remarks |
研究者総覧 池田正人
http://soar-rd.shinshu-u.ac.jp/profile/ja.uhLNPUkh.html
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