2018 Fiscal Year Research-status Report
乳酸菌におけるD-分岐鎖アミノ酸（D-BCAA）の新規機能の解明に関する研究
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18K05412
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| Research Institution | Akita Prefectural University |
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Principal Investigator |
牟田口 祐太 秋田県立大学, 生物資源科学部, 助教 (30724314)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 乳酸菌 / アミノ酸 / D-アミノ酸 / 分岐鎖アミノ酸 / ラセマーゼ / エピメラーゼ / 膜輸送体 / パーミアーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1) 乳酸菌Lactobacillus buchneriのイソロイシン2-エピメラーゼ（Ile 2-E）遺伝子破壊株の作成
平成30年度はL. buchneri JCM 1115におけるIle 2-E遺伝子の破壊に取り掛かった。まず、同株へのマーカー遺伝子導入のために、エレクトロポレーション法による遺伝子導入条件を検討した。広宿主域ベクターpNZ8148を導入遺伝子として用い、コンピテントセルの作成方法、エレクトロポレーション条件を検討した。しかし、L. buchneri JCM 1115への遺伝子導入条件を見出すことはできず、本株を対象としたIle 2-E遺伝子破壊株の作成は困難であると判断した。そこで、L. buchneri以外の乳酸菌でIle 2-Eホモログ遺伝子を持ち、D-BCAAを生産するものについて遺伝子導入を試みた。その結果、Lactobacillus属の2株、Leuconostoc属の3株において遺伝子導入に成功し、L. buchneri以外の乳酸菌によるD-BCAAの機能解析が可能であることが示唆された。
2) アミノ酸膜輸送体推定遺伝子の異種発現系の構築
L. buchneri JCM 1115におけるD-BCAA生産に関与している可能性が高いアミノ酸膜輸送体遺伝子(LB1115_2315)の機能解析を目的として、乳酸菌を宿主としたLB1115_2315の組換えタンパク質発現系の構築に取組んだ。発現タンパク質のN末端またはC末端にHis-tagが付加するよう設計した発現用プラスミドを発現用宿主乳酸菌Lactococcus lactis NZ9000に導入し、発現誘導処理を行った。その菌体を破砕後、膜画分を回収してウェスタンブロッティングに供したところ、LB1115_2315の遺伝子産物であると考えられるタンパク質を検出することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1) L. buchneriのIle 2-E遺伝子破壊株の作成
本研究課題ではD-BCAA生産乳酸菌として一早く見出されたL. buchneri JCM 1115を対象として、D-BCAA生成酵素と考えられるIle 2-Eの遺伝子破壊株を作成する計画であった。しかし、平成30年度の研究により、L. buchneri JCM 1115は遺伝子導入が困難な株であり、同株を対象とした研究遂行が難しいことが明らかとなった。そこで、他のD-BCAA生産乳酸菌株から遺伝子導入が可能な株を見出し、それらの株を新たに研究対象とすることで、本研究課題の目的である「乳酸菌におけるD-BCAAの新規機能の解明」に継続して取り組むこととした。
2) アミノ酸膜輸送体推定遺伝子の異種発現系の構築
平成30年度はL. buchneri JCM 1115が持つアミノ酸膜輸送体推定遺伝子(LB1115_2315)の乳酸菌L. lactis NZ9000における組換えタンパク質発現系の構築を計画していた。この計画通り、発現ベクターの構築、目的遺伝子の発現誘導操作を行った後、発現宿主の膜画分から、目的の組換えタンパク質と考えられるタンパク質を検出することに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) D-BCAA生産乳酸菌のIle 2-Eホモログ遺伝子破壊株の作成
遺伝子導入が可能であることが確認できたD-BCAA生産乳酸菌のうち、遺伝子導入効率が高い株およびD-BCAA生産量が高い株を対象として今後の研究を行う。まず、対象乳酸菌株が保存するIle 2-Eホモログ遺伝子の組換えタンパク質発現系を構築し、Ile 2-Eホモログ遺伝子の遺伝子産物がIle 2-E活性を有することを確認する。その後、対象乳酸菌株のIle 2-Eホモログ遺伝子破壊株の作成を目指す。また、破壊したIle 2-Eホモログ遺伝子の相補実験を行うため、グラム陽性菌広宿主域ベクターであるpNZ8148を基にIle 2-Eホモログ発現ベクターを構築し、対象乳酸菌株における外来Ile 2-Eホモログ遺伝子の発現系を構築する。
2) アミノ酸膜輸送体推定遺伝子の機能解析
ウェスタンブロッティングにて検出された目的タンパク質と考えられるタンパク質のN末端アミノ酸配列を解析し、発現宿主の膜画分にアミノ酸膜輸送体推定遺伝子(LB1115_2315)の組換えタンパク質が発現していることを確認する。その後、放射性同位体14C標識したL-BCAAを用いて、該当アミノ酸膜輸送体を発現させた組換え乳酸菌のL-BCAAの取り込み活性を測定する。また、該当アミノ酸膜輸送体遺伝子とIle 2-E遺伝子を共発現させた組換え乳酸菌の培養液中D-BCAA濃度をモニタリングし、D-BCAA排出活性を検討する。
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| Causes of Carryover |
消耗品や管理物品の購入時に、予想よりも大きな割引が数件あったため、数千円の次年度使用額が生じた。
来年度請求分の助成金と合わせて、消耗品の購入に使用する。
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