2019 Fiscal Year Research-status Report
乳酸菌におけるD-分岐鎖アミノ酸（D-BCAA）の新規機能の解明に関する研究
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18K05412
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| Research Institution | Akita Prefectural University |
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Principal Investigator |
牟田口 祐太 秋田県立大学, 生物資源科学部, 助教 (30724314)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 乳酸菌 / アミノ酸 / D-アミノ酸 / 分岐鎖アミノ酸 / ラセマーゼ / エピメラーゼ / 膜輸送 / パーミアーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1）D-分岐鎖アミノ酸（D-BCAA）生産乳酸菌のイソロイシン2-エピメラーゼ（Ile 2-E）推定遺伝子の機能解析
D-BCAAを生産する乳酸菌のうち、Lactobacillus属4株、Leuconostoc属3株、Weissella属1株について、これらの乳酸菌株が有するIle 2-E推定遺伝子から発現するタンパク質の酵素学的機能を解析した。大腸菌を用いて各Ile 2-E推定遺伝子から組換えタンパク質を発現させ、アフィニティーカラムクロマトグラフィーにて高度に精製した。得られた8種全ての精製タンパク質はIle 2-E活性を有しており、Ile 2-E活性におけるkcat/Km値はいずれの場合も既知の細菌由来アミノ酸異性化酵素のものと同程度以上だった。また、それらは全てロイシンラセマーゼ及びバリンラセマーゼ活性を有していた。以上の結果から、上記8株の乳酸菌において、Ile 2-E推定遺伝子から実際にIle 2-E活性をもつタンパク質が発現し、D-BCAA生産に関与することが示唆された。
2）アミノ酸膜輸送体推定遺伝子(LB1115_2315)の異種発現
Lactobacillus buchneri JCM 1115が有するアミノ酸膜輸送体遺伝子(LB1115_2315)を乳酸菌Lactococcus lactis NZ9000において発現させた時、この遺伝子を発現させた場合に特異的に現れるタンパク質を膜画分に見出した。しかし、その質量がLB1115_2315のアミノ酸配列から推定されるものよりも小さいことから、このタンパク質がLB1115_2315に由来することをN末端アミノ酸配列解析で確認することとした。今年度は該当タンパク質の精製・濃縮を行うため、膜画分からの可溶化条件を検討し、0.025%以上のSDSで処理することで可溶化できることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1）D-BCAA生産乳酸菌のIle 2-E遺伝子破壊株の作成
平成31年度からL. buchneri以外のD-BCAA生産乳酸菌を研究対象として、本研究課題の目的である「乳酸菌におけるD-BCAAの新規機能の解明」に取り組むこととした。本年度は、本研究で見出した8株のD-BCAA生産乳酸菌が持つIle 2-E推定遺伝子から実際にIle 2-E活性を有するタンパク質が発現することを見出した。研究対象となる菌株を変更したことにより研究計画に遅れが生じているが、複数の乳酸菌由来のIle 2-Eホモログタンパク質の酵素学的特徴を明らかにする等、当初の予定にはなかった研究成果を着実に得ている。
2）アミノ酸膜輸送体推定遺伝子(LB1115_2315)の異種発現
平成31年度は乳酸菌L. lactis NZ9000で発現させたアミノ酸膜輸送体推定遺伝子(LB1115_2315)の組換えタンパク質の機能解析を予定していた。しかし、LB1115_2315を発現させた場合に特異的に現れるタンパク質が実際にLB1115_2315に由来することを確認するため、N末端アミノ酸配列解析で確認することとした。今年度は目的のタンパク質を膜画分から可溶化するための条件を見出すことに成功したが、N末端アミノ酸配列解析には至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
1）D-BCAA生産乳酸菌のIle 2-E遺伝子破壊株の作成
遺伝子導入が可能であり、且つIle 2-Eを有していることが確認できたD-BCAA生産乳酸菌のうち、遺伝子導入効率が高い株およびD-BCAA生産量が高い株を対象として、Ile 2-E遺伝子破壊株の作成を目指す。遺伝子破壊には相同組換え法を用いることを予定しており、まずは薬剤耐性マーカー遺伝子の上下流側に、乳酸菌ゲノム上のIle 2-E遺伝子の上下流側と同一の配列をそれぞれ付与したDNA断片を構築する。この遺伝子破壊用DNA断片を乳酸菌細胞内に導入し、相同組換えによるIle 2-E遺伝子破壊を試みる。また、破壊したIle 2-Eホモログ遺伝子の相補実験を行うため、グラム陽性菌広宿主域ベクターであるpNZ8148を基にIle 2-Eホモログ発現ベクターを構築し、対象乳酸菌株における外来Ile 2-Eホモログ遺伝子の発現系を構築する。
2）アミノ酸膜輸送体推定遺伝子の機能解析
発現宿主の膜画分に検出されているLB1115_2315の組換えタンパク質と考えられるタンパク質のN末端アミノ酸配列を解析し、LB1115_2315由来のタンパク質が実際に発現していることを確認する。その後、放射性同位体14Cで標識したL-BCAAを用いて、該当アミノ酸膜輸送体を発現させた組換え乳酸菌のL-BCAAの取り込み活性を測定する。また、該当アミノ酸膜輸送体遺伝子とIle 2-E遺伝子を共発現させた組換え乳酸菌の培養液中D-BCAA濃度をモニタリングし、D-BCAA排出活性を検討する。
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Research Products
(1 results)
