2021 Fiscal Year Research-status Report

乳酸菌におけるD-分岐鎖アミノ酸（D-BCAA）の新規機能の解明に関する研究

Research Project

Project/Area Number	18K05412
Research Institution	Akita Prefectural University
Principal Investigator	牟田口祐太秋田県立大学, 生物資源科学部, 助教 (30724314)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2023-03-31
Keywords	乳酸菌 / アミノ酸 / D-アミノ酸 / 分岐鎖アミノ酸 / ラセマーゼ / エピメラーゼ / 膜輸送 / パーミアーゼ
Outline of Annual Research Achievements	1) D-分岐鎖アミノ酸生産乳酸菌のイソロイシン2-エピメラーゼ遺伝子破壊前年度に引き続き、D-分岐鎖アミノ酸(D-BCAA)生産乳酸菌Lactobacillus fermentum NBRC 3956およびLeuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides JCM 6124 を対象として、相同組換えによるイソロイシン2-エピメラーゼ遺伝子(ise)の破壊を試みた。これらの乳酸菌細胞内で複製されないプラスミドを基に構築した遺伝性破壊用プラスミドや、相同組換え領域とマーカー遺伝子から成る遺伝子破壊用線状DNA断片を用いて遺伝子破壊株の獲得を試みた。また、遺伝子破壊株獲得の効率化を図るため、温度感受性プラスミドpKO-1000を検討することとした。今年度はNBRC 3956及びJCM 6124を対象に、pKO-1000を用いた遺伝子破壊に最適な培養温度の条件を検討し、NBRC3956においてその条件を見出した。 2) アミノ酸膜輸送体推定遺伝子(LB1115_2315)の機能解析今年度はLactobacillus buchneri JCM 1115のゲノム中でLB1115_2315とiseの上流側にあるプロモーターを共にクローニングし、このプロモーターによるLB1115_2315の異種発現の構築を試みた。しかしながら、大腸菌を宿主としたクローニングでは目的のプラスミドを保持するクローンを得ることができなかった。加えて、NBRC 3956及びJCM 6124ゲノム中のiseに隣接するアミノ酸膜輸送体推定遺伝子(それぞれLAF_1620、LEUM_0554)についても、同様のクローニングを試みたが、目的のプラスミドは構築できなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 1）D-BCAA生産乳酸菌のise破壊株の作成前年度に引き続き、NBRC 3956およびJCM 6124 のise破壊を試みたが、破壊株は獲得できていない。そこで、効率的な遺伝子破壊を可能とする温度感受性プラスミドによる遺伝子破壊の検討に着手した。これまでに、NBRC 3956において遺伝子破壊株選抜の培養温度を見いだすことに成功しているが、ise破壊株の獲得までには至っておらず、研究計画に遅れが生じている。 2）アミノ酸膜輸送体推定遺伝子の機能解析 JCM 1115およびNBRC 3956、JCM 6124からアミノ酸膜輸送体推定遺伝子とiseをクローニングし、異種発現系による各アミノ酸膜輸送体推定遺伝子の発現タンパク質の活性検出を試みてきた。これまでに、JCM 1115由来の目的タンパク質と考えられるタンパク質の発現は確認できているが、アミノ酸膜輸送の活性は検出できていない。また、NBRC 3956、JCM 6124においては、目的タンパク質の発現系構築には至っておらず、研究計画は遅れている。
Strategy for Future Research Activity	1）D-BCAA生産乳酸菌のise破壊株の作成 NBRC 3956を対象に温度感受性プラスミドpKO-1000によるise破壊株の獲得を目指す。得られたise破壊株は、その遺伝子の発現パターンを野生株と比較し、D-BCAAが乳酸菌の生命活動に与える影響について情報を得る。また、ゲノム情報からiseのホモログを持たないJCM 1115やNBRC 3956のLactonacillus属近縁種の培養液にD-BCAAを添加し、その生育や形態、遺伝子発現に与える影響を検討する。これにより、ise破壊株が獲得できなかった場合でも、D-BCAAが乳酸菌に与える影響についての知見を得る。 2）アミノ酸膜輸送体推定遺伝子の機能解析令和2年度までにナイシン誘導型の強制発現系プロモーターを利用することで、JCM 1115由来の目的タンパク質と考えられる膜タンパク質の発現に成功している。しかし、この系における宿主細胞のD-BCAAの排出活性を検討したところ、活性は検出できなかった。そこで、今後は同発現系を用いて、D-BCAA及びL-BCAAの細胞内への取り込み活性を検討する。また、同発現系をNBRC 3956およびJCM 6124由来のアミノ酸膜輸送体推定遺伝子の発現に応用し、D, L-BCAAの排出及び取込み活性を検討する。
Causes of Carryover	本研究の補助事業期間は平成30年度から令和3年度までであったが、研究の進捗が遅れているため、補助儀業期間の延長を申請した。令和4年度の助成金の交付は計画になかったため、次年度使用額として生じた金額は令和4年度まで延長した研究の遂行に必要な消耗品の購入に使用する。