2018 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of molecular mechanism of super-induced secretion of lipase and construction of useful protein mass production system
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18K05414
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| Research Institution | Chuo University |
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Principal Investigator |
石塚 盛雄 中央大学, 理工学部, 教授 (50168241)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
赤沼 元気 立教大学, 理学部, 助教 (30580063)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | リパーゼ / リパーゼ・スーパーインデューサー / バイオサーファクタント / Fatty alcohol / 長鎖エーテル / 脂質 / シグナル伝達 / 細胞内ポリエステル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高級アルコールのstearyl alcohol (StOH)によるリパーゼ（lipase）超発現・超分泌時に発現量が増加したタンパク質の中から、プロテオーム解析によりアルコール脱水素酵素（AdhA）を同定され、その遺伝子欠損株ではlipase生産量が低下することが判明している。StOHの細胞内における代謝がlipase超誘導に重要であることが示唆されたが、lipase超誘導発現システムとAdhAの関連を決定づけるためには adhA遺伝子相補株が必要があるので、AdhA遺伝子相補株の作製を試みて、相補株作製用組換えDNAを構築した。他方、野生株とadhA欠損株で、培地にStOHの替りに水溶性長鎖エーテルのpolyoxyethylene 20 oleyl ether（POE20）を加えた時のlipase活性に大きな差は見られなかったことから、StOHと水溶性POE20は異なる誘導の経路を通ることが示唆された。StOHの取り込みにおいて重要な役割を果たしていることが示唆されている界面活性タンパク質（EliA）単独ではStOHの乳化や細胞表面疎水性への関与が観察されなかったが、界面活性糖脂質のRhamnolipid添加によりStOHの資化促進が観察できた（lipaseの超誘導現象は確認できていない）。EliAは分子量約15kDaと比較的小さいので、EliAの結晶を得ることができたが、高相同性配列を有するタンパク質のX線結晶解析データは未だ公表されていないので、位相を特定するために重原子置換が必要である。塩化水銀を用いた重原子置換法が成功していないので、Se-Met置換タンパク質の調製を試みている。LipaseとEliAは互いに異なった転写システムであることが解り、共超発現・分泌ネットワークは、より複雑な間接的経路の存在が示唆される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「研究の目的」の達成度について、今年度の研究実施計画に基づいて、以下の4点について、ほぼ研究計画に沿った進展が見られた。①リパーゼ超発現・超分泌機構の解明：Ralstonia sp. NT-80由来lipase超発現・分泌への一連のsuper-inducer群のうち、高級アルコールのstearyl alcohol (StOH)と水溶性長鎖エーテルのpolyoxyethylene 20 oleyl ether（POE20）との作用機構の違いが、アルコール脱水素酵素（AdhA）遺伝子欠損株を用いた実験から示唆された。②EliA界面活性タンパク質の超発現・分泌機構の解明：lipase超誘導・分泌現象の鍵タンパク質推定される界面活性タンパク質（EliA）単独ではStOHの乳化や細胞表面疎水性への関与が観察されなかったが、界面活性糖脂質のRhamnolipid添加によりStOHの資化促進が観察できた（lipaseの超誘導現象は確認できていない）。③EliAタンパク質の結晶化による構造と機能解析：EliAは分子量約15kDaと比較的小さいので、EliAの結晶を得ることができたが、高相同性配列を有するタンパク質のX線結晶解析データは未だ公表されていないので、位相を特定するために重原子置換が必要である。塩化水銀を用いた重原子置換法が成功していないので、Se-Met置換タンパク質の調製を試みている。このために、別予算で高価な全自動タンパク質合成装置を購入して、メーカーに簡便なSe-Met置換タンパク質の調製キットの作製を依頼した。④リパーゼとEliAタンパク質との共超発現・分泌ネットワークの解明：StOH によるlipaseとEliA遺伝子の転写システムは互いに異なっていることが解り、共超発現・分泌ネットワークは、より複雑な間接的経路の存在が示唆される。
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| Strategy for Future Research Activity |
①超発現・超分泌・超蓄積ネットワークの統一的理解（石塚、赤沼）。
平成３０年度に判明したスーパー・インデューサーによるリパーゼ、界面活性保有EliAタンパク質の相互関連性に、細胞内ポリエステル（PHA）超大量蓄積の分子機構を加えて同様の検討を行い、超共分泌システムの統一的分子機作を解明する。②分子進化工学による高立体選択性リパーゼの創製（石塚）。部位特異的変異法と分子進化工学的手法による高立体選択性リパーゼの創製を試みる。③超発現・超分泌システムを用いた改良リパーゼの大量生産（石塚、赤沼）。リパーゼ超発現・超分泌制御領域を付加した発現ベクターを構築して、改良された高立体選択性リパーゼ遺伝子を組み込み、アフィニティによる精製の為の工夫も行って、大量生産コンビナトリアルシステムを構築する。
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| Causes of Carryover |
科研費申請当初、機器備品として、全自動無細胞タンパク質合成装置の購入を予定していたが、交付額が申請額の約三分の二となり、研究分担者への配分額を差し引くと購入困難のため、別予算で購入したこと、本研究に必要不可欠なRT(q)-PCR装置の故障に伴う更新も別予算で処理できたことに加えて、研究分担者が使用しなかったため、次年度繰越研究費が生じた。翌年度に請求研究費と合わせて、試薬等の消耗品、解析委託、成果公表等に支出する予定である。尚、タンパク質結晶化装置あるいは判別装置の大幅な価格低下が生じる場合には、購入を検討する。
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[Presentation] Functional splicing of hag messenger RNA coding for bacterial flagellin from thermophilic Geobacillus sp. Kps32018
Author(s)
Morio Ishizuka, Tatsuya Ishida, Wataru Umano, Nana Ishibashi, Yuriko Sakaguchi, Takeo Suzuki, Tsutomu Suzuki, Takako Awai, Genki Akanuma and Jumpei Hayakawa
Organizer
24th Congress of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB 2018), Seoul, Republic of Korea, June 4-8, 2018
Int'l Joint Research
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[Presentation] 好熱性真正細菌 Geobacillus Kps3 の hag mRNAの選択的スプライシング2018
Author(s)
石田 達矢, 馬野 航, 千葉 献人, 早川 准平, 赤沼 元気, 今井 洋, 坂口 ゆりこ, 鈴木 健夫, 上村 慎治, 鈴木 勉, 粟井 貴子, 石塚 盛雄
Organizer
第４１回日本分子生物学会年会(パシフィコ横浜)， 発表番号[1P-0018]，2018(平成30)年11月28日（水）～30日（金）
