2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of molecular mechanism of super-induced secretion of lipase and construction of useful protein mass production system
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18K05414
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| Research Institution | Chuo University |
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Principal Investigator |
石塚 盛雄 中央大学, 理工学部, 教授 (50168241)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
赤沼 元気 学習院大学, 理学部, 助教 (30580063)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | リパーゼ / Lipase super-inducer / iosurfactant / Fatty alcohol / 長鎖エーテル / 脂質代謝 / シグナル伝達 / 細胞内ポリエステル蓄積 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Stearyl alcohol(StOH、高級アルコール)等の培養培地への添加による界面活性タンパク質（EliA）とリパーゼ（lipase）超発現・超分泌、及び生分解性ポリエステルのpolyhydroxyalkanoate（PHA）の細胞内大量蓄積時に、発現量増加タンパク質の中から、プロテオーム解析によりアルコール脱水素酵素（AdhA）が同定され、その遺伝子（adhA）欠損株ではlipase生産量が低下することが判明している。相同組換え技術によりadhA相補株の作製に成功し、StOHを加えた時のAdhA・lipase活性が野生株培養時のAdhA・lipase活性と同程度まで回復したので、StOHによるlipase超発現・超分泌にはAdhAの発現が必須であることが判明した。AdhAによるStOHの酸化を経由したaldehyde、脂肪酸への酸化、β-酸化経路によるアセチルCoAの大量蓄積、生分解性ポリエステルのpolyhydroxyalkanoate（PHA）の大量蓄積経路の推定が可能になった意義は大きい。研究代表者らの今までの研究により、二種類のlipaseと一種類のカルボン酸エステルesteraseが見出され、その遺伝子配列、発現タンパク質の性質の一部が判明した。二種類のlipaseは共に50℃でも安定で、超発現誘導・分泌生産可能であり、例えばNT80-lipaseはt-buthyl-3-acetoxy-butanoate、NT92-lipaseはEthyl-2-heptanoateに良好な立体選択性を有し、部位特異的アミノ酸置換法で熱安定性に寄与するアミノ酸残基についても徐々に解明されてきたので、このままでも実用的応用が可能である。NT80-esteraseはlactone特異的酵素作用があるが、熱に不安定な為、分子進化工学的手法により12℃の熱安定性向上に成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
3年以上に及ぶ新型コロナウィルス感染症（COVID-19）のパンデミックな流行に伴う本格的実験の自粛により、研究代表者の研究室のみならず、研究分担者の研究室でも、対面による実験技術講習会や十分な実験時間が確保できず、本研究課題の進捗状況は当初予定よりやや遅れている。幸いにも令和5年(2023年)3月13日に1年間の補助事業期間再延長承認申請が認められたので、次年度繰越研究費の試薬等の消耗品、解析委託、成果公表等への支出も生かして、当初の研究目的の達成を期す予定である。更に、StOHに加えて、その代謝産物のstearyl aldehyde, stearic acidを混合して添加した場合は、リパーゼ遺伝子の転写量の更なる急上昇、約35 kDaタンパク質の大量分泌現象が見いだされ、本システムの機構解明と実用化の意義は極めて大きいと思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
相同組換え技術によりAdhA遺伝子（adhA）相補株の作製成功により、AdhAによるStOHの酸化を経由したaldehyde、脂肪酸への酸化、β-酸化経路によるアセチルCoAの大量蓄積、生分解性ポリエステルのpolyhydroxyalkanoate（PHA）の大量蓄積経路の推定が可能になった意義は大きいが、Lipaseの超発現・超分泌現象については、油脂を誘導剤としたLipQ・lipRの2 component systemだけでは説明不十分で、aldehyde等、上記代謝経路の中間産物の影響についての詳細な検討が必要である。野生株とadhA欠損株で、培地にStOHの替りに水溶性長鎖エーテルのpolyoxyethylene 20 oleyl ether（POE20）を加えた時のlipase活性に大きな差は見られなかったことから、StOHと水溶性POE20は異なる誘導の経路を通ることが示唆されている。今後、更なる共超発現・分泌ネットワークの解明が必要である。Ralstonia sp. NT-80由来のラクトン特異的esterase（EstA）については、既に分子進化工学的手法により12℃の熱安定性向上に成功している【日経産業新聞報道記事、2013年8月5日（月）付、11面（先端技術）中大が酵素開発 ５０度でも壊れず「中央大学の石塚盛雄教授と赤沼元気助教らは・・・」報道資料参照】ので、eliA、lipA遺伝子領域へのEstA遺伝子(estA)挿入によりEstA超発現・分泌システム導入法と大量調製法を確立する。また、時間的余裕があれば超発現・分泌システムの大腸菌等の他菌種への移植を試みる。COVID-19の世界的流行により、研究の進展の遅れが生じたが、幸いにも令和5年(2023年)3月13日に1年間の補助事業期間再延長承認申請が認められたので、当初の研究目的の達成を期す予定である。
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| Causes of Carryover |
3年以上に及ぶ新型コロナウィルス感染症（COVID-19）のパンデミックな蔓延に伴う本格的実験の自粛により、次年度使用額が生じた。幸いにも令和5年(2023年)3月13日に1年間の補助事業期間再延長承認申請が認められたので、当初の研究目的を達成するために、試薬等の消耗品、解析委託、成果公表等に支出する予定である。
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Research Products
(14 results)
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[Presentation] Alternative splicing of hag mRNA coding for Flagellin from a thermophilic eubacterium Geobacillus sp. Kps3 in vivo and in vitro2022
Author(s)
M. Ishizuka, Y. Nakahara, D. Nihei, W. Kotoda, T. Ishida, T. Awai, G. Akanuma, J. Hayakawa, Y. Sakaguchi, T. Suzuki, T. Suzuki
Organizer
The 25th IUBMB Congress, the 46th FEBS Congress and the 15th PABMB Congress, in one single global event named The Biochemistry Global Summit, Lisbon, Portugal, the 9th to the 14th July 2022.
Int'l Joint Research
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