2020 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of silencing of exogenous genes in bacteria harboring chimera-genome.
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18K05417
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
朝井 計 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (70283934)
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2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 遺伝子サイレンシング / DNAメチル化 / エピジェネティクス / 水平伝搬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）枯草菌内で構築できた、シアノバクテリア由来のRNAPコア酵素遺伝子群を枯草菌+シアノバクテリアであるシアノバチル細胞内のゲノムに組込んだ。枯草菌内ではシアノバクテリアの主要シグマ因子SigAの発現に難攻しているので、効率よく発現し、かつ活性をもつシアノバクテリアの選択的シグマ因子SigFをシアノバチルスに導入し、シアノバクテリア由来のRNAPホロ酵素の構築を目指している。その後、シアノバクテリアゲノムを枯草菌ゲノムに部分的に導入した枯草菌株等も利用し、シアノバクテリア由来の遺伝子の発現誘導をシアノバクテリアゲノムの部位別に観察する。シアノバチルスは形質転換能が低下している上に、薬剤選択マーカーが複数使われていて、遺伝学的な扱いが難しい。そこで、接合伝達によってDNAを細胞内に送り込み、細胞内でゲノム編集可能なプラスミドを構築した。これを用いたシアノバチルスの遺伝子改変（必要な薬剤選択マーカーをゲノム編集によりゲノムから欠失させる等）を実際に試みている。
２）枯草菌内在のDNAメチル化酵素に加えて、異種細菌の複数のDNAメチル化酵素を枯草菌内で発現させ、DNAメチル化によるエピジェネティックな遺伝子発現制御について解析した。ある種のDNAメチル化酵素の発現により、枯草菌の高温培養下での増殖が阻害された。また、大腸菌のH-NS核様体タンパク質を枯草菌内で異種発現させたところ、枯草菌ファージの感染に対して、宿主枯草菌の耐性化がみられた。侵入したファージ遺伝子の発現が抑制されたことに起因すると考え解析中である。
３）枯草菌に比較的近縁のゲノムサイズの小さい難培養性の腸内細菌であるセグメント細菌のゲノム導入を開始し、べん毛形成遺伝子群を含む約50kbの連続したゲノム領域の組込みを完了した。H-NS核様体タンパク質の過剰発現による組込んだ遺伝子の転写への影響を確認中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究の実施がやや遅れているとした最大の原因として以下のことが挙げられる。本年度は4月から5月にかけて、コロナ禍の緊急事態宣言等の影響で、大学への教職員、学生の立ち入りが原則禁止され、具体的な研究活動は全くできなかった。解除後の6月以降も、時間制限等、研究室、実験室への立ち入りは厳しい制限がかけられたため、比較的通常の実験環境に復帰できたのは、8月を過ぎてからであった。そのような環境下でも以下に示すように、昨年度予定した実験計画について、ある程度の成果、進展は見られたため、「（４）遅れている」ではなく、「（３）やや遅れている」という区分とした。本年度は３つの実験過程に分けて、実験を計画した。１）枯草菌＋シアノバクテリア＝シアノバチルスのゲノム遺伝子のうち、シアノバクテリア遺伝子の転写が選択的に抑制されているため、シアノバチルス由来のRNAポリメラーゼをまず発現させ、転写抑制解除を試みる段階に達した。シアノバチルス内で機能可能なRNAポリメラーゼホロ酵素の導入までは実施できた。２）細菌でのエピジェネティックな遺伝子発現を観察するために、枯草菌内に外来の核様体タンパク質やDNAメチル化酵素の遺伝子を導入し、人工的に過剰発現させ、宿主の表現型の変化を観察した。その結果、遺伝子発現の変化に起因すると考えられる細胞の表現型の変化が、どちらの実験例においても観察された。３）枯草菌に近縁の細菌のゲノムを大規模に導入し、導入遺伝子の発現と抑制制御、導入した遺伝子群による宿主細胞への影響、表現型・形質の変化を観察し、積極的に誘起させる試みを開始できた。また、導入DNAのサイズは50kb程と少ないが、導入断片のPCRによる増幅や、大腸菌でのクローニングなどでの問題点を洗い出し、解決策をこうじた。また、現在では導入した遺伝子群の遺伝子発現をモニターできるような、準備の段階に至っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）枯草菌＋シアノバクテリア＝シアノバチルスのゲノムに宿主の枯草菌細胞内で発現し、機能することが確認された、RNAポリメラーゼ遺伝子セットを導入し、シアノバチルス細胞内での発現を試みる。導入するシグマ因子は、枯草菌内で機能するSigFを用いる。RNAポリメラーゼの発現をウエスタン法で確認する。シアノバチルスゲノム遺伝子の転写プロファイルの変化をRNA-sequencingにより解析する。形質転換能が低下しているシアノバチルスに対して、接合伝達によるDNA導入とゲノム編集による遺伝子組換えを可能にする既に構築済みのプラスミドを用いて、実際に、数か所導入されている複数の薬剤選択マーカー遺伝子をゲノムから欠失させる。
２）枯草菌内に大腸菌の核様体タンパク質H-NSとstpAを発現誘導した株について、いくつかの実験を行った。枯草菌の溶原化ファージSPβは、枯草菌細胞と混合すると、一部は枯草菌のゲノムに組み込まれ溶原化するが、一部は感染によって枯草菌細胞を溶菌させる。これは寒天培地上でプラークとして観察可能である。H-NSの発現によって、プラーク数が減少した原因を解明する。ファージと細胞を混合したのちに、経時的に細胞からRNAを抽出し、H-NSの発現によるファージ遺伝子の発現変化を観察する。枯草菌に導入した各種メチル化酵素の発現によって、接合伝達にて移送させるDNAをメチル化した時に、供与細胞へのDNAの伝達効率を調べる。
３）枯草菌に近縁の細菌のゲノムの大規模導入を推し進める。現在までの50kbpのDNA領域をさらに延長していくだけでなく、同時並行で複数のDNA領域を導入することでスピードアップを図る。それぞれの導入領域は、接合伝達によって、１つのゲノム上に連結させる。これらと並行して、導入した遺伝子群の塩基配列、転写プロファイルを次世代シーケンサーを使い網羅的に解析する。
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| Causes of Carryover |
（理由）最大の理由は新型コロナウイルスによる社会活動への影響である。「現在までの進捗状況」にも記したが、本年度は4月から5月にかけて、コロナ禍の緊急事態宣言等の影響で、大学への教職員、学生の立ち入りが原則禁止され、具体的な研究活動は全くできなかった。解除後の6月以降も、時間制限等、研究室、実験室への立ち入りは厳しい制限がかけられたため、比較的通常の実験環境に復帰できたのは、8月を過ぎてからであった。従って、昨年度予定した実験計画に要する費用に見直しが生じた。また、研究成果の報告、並びに情報収集のために、参加を予定していた多くの研究会・学会が中止あるいはオンライン開催となり、旅費や学会参加費等の助成金使用が必要ではなくなった。
（使用計画）シアノバチルスの遺伝子発現解析、RNA-sequencing解析などを実施する予定である。そのためのRNA抽出キットや次世代シーケンスに必要な試薬・消耗品費に使用する。加えて、枯草菌+セグメント細菌の菌株の作製を大規模に行う。そのための、遺伝子増幅に使用するPCR用試薬、オリゴDNAの合成等の消耗品・試薬の購入がより一層多くなると思われる。導入したDNAの塩基配列の確認のためのDNA抽出キットやリシーケンスに必要な試薬・消耗品費に使用する。また最終的には、それらの解析結果の学会や研究会における発表と、論文作成を行う費用にあてる。
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