2019 Fiscal Year Research-status Report
Activation of fungal silent secondary metabolite gene clusters using the CRISPR/Cas9 system.
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18K05420
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
尹 忠銖 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 研究員 (40432801)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
本山 高幸 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 専任研究員 (70291094)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 菌類 / ゲノム編集 / 二次代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糸状菌は古くから薬品や農薬等の有用天然化合物の単離源の一つとして注目されてきたが、糸状菌由来、新規天然物の発見は年々難しくなっているのが現状であり、糸状菌が生産する天然物資源が底を突いてきたとも思われた。しかし、近年のゲノム解析技術の進歩によりゲノム解析が急速に進み、糸状菌のゲノム上には今までの予想を遥かに超える数の天然物を作る遺伝子がコードされていることが明らかになり、未利用遺伝子資源として注目を集めている。しかし、天然物を作るはずの二次代謝関連遺伝子群の大部分は一般的実験室培養条件下では休眠状態であることも明らかになっており、この遺伝子群が作るはずの産物も不明であることから糸状菌における休眠遺伝子群活性化方法としてゲノム編集ツールであるCRISPR/Cas9システムを利用することを目指して研究を行っている。
昨年度は糸状菌であるイネいもち病菌をモデルカビとしてカビ毒であるテヌアゾン酸の生合成遺伝子であるTAS1をCRIPSR/dCas9システムを利用して活性化してテヌアゾン酸の生産を確認したことを報告している。本年度はイネいもち病菌におけるCRIPSR/dCas9システムで遺伝子転写活性化因子であるVPR(VP64 (4 x virus protein 16), p65 and Rta(replication and transcription activator) fused gene)の最適化を行った。また、イネいもち病菌が生産する他の二次代謝遺伝子を対象にCRIPSR/dCas9システムの適用を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は昨年度に続き、イネいもち病菌におけるCRIPSR/dCas9システムを利用して遺伝子を活性化する方法の確立と最適化することを目的として研究を進めた。イネいもち病菌の中で正常に動いていることが確認されたCas9遺伝子はイネいもち病菌遺伝子コドンに合わせてあるものを使用していたが遺伝子活性化因子であるVPR (VP64 (4 x virus protein 16), p65 and Rta(replication and transcription activator) fused gene)は酵母の遺伝子コドンに合わせてあるものを使用していたので今回はVPRもイネいもち病菌の遺伝子コドンに最適化したものを作製した。昨年度はテヌアゾン酸を生合成する一つの遺伝子TAS1をCRIPSR/dCas9システムを利用して活性化しているが今年度はイネいもち病菌が生産するNectriapyroneの生合成遺伝子であるNEC1 (polyketide synthase)とNEC2 (O-methyl transferase)を同時に活性化するCRIPSR/dCas9システムの構築を行った。前回と同じくdCas9に新しく最適化したVPRを遺伝子活性化因子として用いた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は本年度の続きの研究を行う。イネいもち病菌の二次代謝産物生産関連遺伝子群の中で本研究室でその生産化合物を明らかにしたnectriapyrone生産遺伝子群に対する遺伝子活性化株の解析を行う。また、NEC1とNEC2を活性化するため作製したguide-RNAのターゲッティング部位の調節し、活性化率の最適化を目指す。
CRISPR/dCas9システムで複数遺伝子の同時活性化が確認できたら三つ以上の生合成遺伝子で二次代謝産物（未知の生産物）を生産することが予想される遺伝子群に対しても活性化を行い新規二次代謝化合物の取得を目指す。
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| Causes of Carryover |
前年度の未使用額からdCas-VPR fusion遺伝子の作製を行った。今年度はCovid-19による学会の取り消しなどで未使用額が発生している。未使用額は次年度予算に合わせて参加学会を追加して使用する。
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