2020 Fiscal Year Research-status Report
Activation of fungal silent secondary metabolite gene clusters using the CRISPR/Cas9 system.
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18K05420
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
尹 忠銖 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 研究員 (40432801)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
本山 高幸 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 専任研究員 (70291094)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 菌類 / ゲノム編集 / 二次代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糸状菌を含むカビ類は古くからペニシリンをはじめとする抗生物質や様々な天然生理活性物質の生産菌である。糸状菌のゲノム上には天然化合物を作ることが知られている二次代謝関連遺伝子が数多くコードされているがその大部分は一般的実験室培養条件下では休眠状態であることも明らかになっていることからこれらの遺伝子群を活性化し新規化合物を単離するため多くの研究が行われ来た。従来の活性化方法としては発現プロモーター置換やエピジェネティック調節による遺伝子群の活性化、異種宿主に目的とする遺伝子群を発現させる方法を用いて一定の結果が得られているが限られた遺伝子にしか適用できないのが現実であることから本研究では糸状菌における新しい休眠遺伝子群活性化方法としてゲノム編集ツールであるCRISPR/Cas9システムを利用することを目指して研究を行っている。昨年度まではイネいもち病菌をモデルカビとして一つの生合成酵素で作られることが知られているカビ毒、テヌアゾン酸の生合成遺伝子であるTAS1をCRIPSR/dCas9システムを利用して活性化してテヌアゾン酸の生産に成功し、CRIPSR/dCas9システムで遺伝子転写活性化因子であるVPR(VP64 (4 x virus protein 16), p65 and Rta(replication and transcription activator) fused gene)の最適化も行った。本年度は最適化した遺伝子活性化因子を用いてイネいもち病菌の中で生合成される化合物、nectriapyroneの生産に必要な二つの遺伝子（NEC1, NEC2）を同時に活性化できるバイナリプラスミドを構築し、イネいもち病菌のゲノム上で発現させるためイネいもち病菌の形質転換を行い、形質転換体の解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度はCovid-19のパンデミックにより研究室のシャットダウンや出入り制限などがあり、研究の進捗が遅れていることから研究期間を一年間延長して研究を行うことにした。今年度はCRIPSR/dCas9システムを利用して遺伝子を活性化する大きなメリットとして考えられる二つ以上の遺伝子を同時に活性化することを試すためイネいもち病菌の中で二つの遺伝子NEC1 (polyketide synthase)、 NEC2 (O-methyl transferase)で生合成されることが知られているNectriapyroneの生産誘導を行うことにした。イネいもち病菌のゲノム上でdCas9タンパク質と転写活性化因子VPRをTEFプロモーターで常時発現させ、NEC1とNEC2遺伝子の上流にdCas9-VPRをターゲティングするガイドRNAをプロモーターU6-1とU6-2で発現させる遺伝子配列をデザインしてイネいもち病菌の形質転換を行った。得られた形質転換候補株はPCRによりデザインした正しい配列が組み込まれたかの確認を行い正しい形質転換体を複数得た。現在、形質転換体を培養して化合物の確認及び遺伝子の発現レベルを調べている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は本年度の続きの研究を行う。Nectriapyrone生産誘導のためにdCas9-VPRを用いてNEC1、NEC2遺伝子を発現誘導する目的で作製した形質転換株の解析を行いnectriapyroneの生産及び各遺伝子の発現レベルを確認する。遺伝子の発現レベルや化合物生産量が充分でない場合はガイドRNAのターゲティング部位を変化させ、最適化を目指す。nectriapyroneの生産誘導に成功した場合はイネいもち病菌のゲノム中で3個以上の二次代謝関連遺伝子クラスターで生合成されると予想される未知代謝産物を生産誘導するため3以上の遺伝子を同時発現誘導できるdCas9-VPRシステムを構築して生産物を確認することを目指す。
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| Causes of Carryover |
今年度はCovid-19のパンデミックにより研究室のシャットダウンや出入り制限などがあり、研究が予定通り進まず未使用額が発生している。未使用額は研究期間を延長しているので次年度の研究費として使用する予定である。
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