2020 Fiscal Year Research-status Report

Study on oxygen-dependent translational control for metabolic regulation

Research Project

Project/Area Number	18K05421
Research Institution	Institute of Physical and Chemical Research
Principal Investigator	松山晃久国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 専任研究員 (90399444)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2022-03-31
Keywords	翻訳
Outline of Annual Research Achievements	ハイプシン化と呼ばれる特殊な翻訳後修飾を受けるeIF5Aは、近年の研究において翻訳の伸長反応で特定のアミノ酸配列を有するタンパク質の翻訳を促進することが明らかになっている。ハイプシン化は一段階目の反応でeIF5Aにデオキシハイプシンが付加され、二段階目でその側鎖に水酸基が付加される。ハイプシン化残基は高等生物では生育に必須であるが、酵母では水酸基が欠損しても生育可能である。そこで、我々はこれまでに水酸基の付加にのみ欠損が生じる分裂酵母のmmd1変異体を用いて、翻訳に影響を受けるタンパク質を探索してきたが、同定したタンパク質の多くは、従来提唱されているようなeIF5Aを翻訳に必要とするアミノ酸配列を有していないことから、eIF5Aはハイプシン化修飾の状況に応じて異なるタンパク質を翻訳の標的としていることが予想された。昨年度までにタンパク質の条件的ノックダウンが可能なAIDシステムを用いることによってハイプシン化に関わる酵素Dys1とMmd1を人為的に制御可能な株の作製を目指してきたが、これらのタンパク質のノックダウンはうまく起こらなかった。本年度は改変型オーキシンを用いた改良型AIDシステムが最近開発されたことから、これがDys1のノックダウンに効果があるかどうかを調べたが、このシステムでも少なくともDys1やMmd1に対しては効果を示さなかった。一方で、mmd1変異株等ではハイプシン化の不全によりeIF5Aのアセチル化が亢進することから、アセチル化の役割についても検討することにした。アセチル化の有無により、どのような配列の翻訳においてリボソームが影響を受けるかを調べるため、mmd1遺伝子破壊株及びさらにこのバックグラウンドでアセチル化できないようにした点変異株を作製した。さらに、これらの株からリボソームプロファイリング解析用のサンプルの調製を完了した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 昨年度までにDys1をAIDシステムによりノックダウンすることで条件特異的にデオキシハイプシン化が起こらない状態を作り出せるかどうか検証していたが、従来のAIDシステムではDys1のノックダウンはうまく起こらないことが判明し、さらに本年度改変型オーキシンを用いたAIDシステムを試したが、それでもDys1のノックダウンには効果がなかった。そのため、ハイプシン残基中の水酸基ではなく、アセチル化の効果を調べるためのサンプルを調製してリボソームプロファイリング解析を行うことにしたが、コロナ禍のため、シークエンス解析サービスが受け入れ中止になる等の影響を受け、計画通りには進められなかった。
Strategy for Future Research Activity	すでに調製したデオキシハイプシン化・高アセチル化を受けた状態のeIF5A及びデオキシハイプシン化・非アセチル化状態のeIF5Aを発現する分裂酵母から調製したリボソームプロファイリング解析用サンプルについて次世代シークエンスを行い、リボソームが渋滞を起こしている個所を探索していく。これにより、eIF5Aのアセチル化修飾の役割について考察する。一方で、これまでに作製したものの期待通りのノックダウン結果が得られなかったDys1およびeIF5Aそのもののノックダウン株についてもさらなる検討を行う。具体的には、近年分裂酵母でもCrispｒ/Cas9によるゲノム編集技術を用いた発現制御システムが利用できるようになったことから、本システムを用いてeIF5AやDys1の発現抑制を行う。目的の株が作製できた場合は、リボソームプロファイリング解析を実施し、eIF5Aの各修飾段階におけるリボソームの翻訳効率について検討を行う。
Causes of Carryover	本来ならば、リボソームプロファイリング用に調製したサンプルを次世代シークエンスにより解析する予定であったが、コロナ禍で実験がスムーズに進められなかったことに加え、委託予定だったカルフォルニア大学バークレー校でもシークエンス受託サービスが閉鎖される等したため、2020年度中にシークエンス解析に委託することができなかったことから未使用額が生じた。