2018 Fiscal Year Research-status Report
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18K05424
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
福田 展雄 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (00613548)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 酵母 / 倍数体 / 遺伝子発現 / DNA修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では出芽酵母を宿主として選定し、高次倍数体におけるゲノム安定性向上の実現可能性を検証することを目的とする。相同組換えには複数の経路が存在し、全容解明には未だ至っていない。そこで相同組換えDNA修復の寄与度を明らかにするため、主要遺伝子の発現量とDNA修復エラー発生率の関係を調査することとした。
平成30年度は、一倍体酵母を掛け合わせて二倍体、三倍体、四倍体の菌株を作製し、最も不安定な染色体であるとされる第三染色体の挙動を追跡した。当染色体のセントロメアの左右には、ロイシン生合成経路の酵素をコードする遺伝子座と、酵母の性決定を司る遺伝子座が存在する。ここで各倍数体の酵母には機能を保持したロイシン合成酵素遺伝子を酵母のゲノム中に1コピーのみ保有するよう改変を加えた。これらの酵母を培養した際に、DNA修復エラーの発生によって性決定遺伝子座が同一の配列に変化した酵母の出現頻度を調査した。また培地へのロイシン添加の有無の条件を変えて増殖特性を調べることでDNA修復エラーの種類（染色体の喪失またはヘテロ接合性の消失）を判別することができる。上述のDNA修復エラーを起こした酵母を対象として、各エラーの発生比率を定量的に評価した。
また相同組換えDNA修復にかかる各主要遺伝子の発現量を人為的に変動させるため、各遺伝子のプロモーターを、ガラクトースを添加することで強力な発現誘導が可能なプロモーターと置換した遺伝子発現カセットを作製した。さらにこれらのDNA断片を用いて酵母の染色体DNAと相同組換えを行うことにより、各主要遺伝子に関して発現量を変動させることが可能な一倍体酵母をそれぞれ作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度は年度当初の計画に記した通り、DNA修復エラーの発生頻度と各エラーの発生比率を定量的に評価するための実験手法を確立することに成功した。また次年度に想定している酵母倍数体創製に備えて、相同組換えDNA修復にかかる各主要遺伝子の発現量を人為的に変動させるために必要となる一倍体酵母株を取り揃えることに成功した。以上の結果から、平成30年度の計画はおおむね順調に進展しているものと判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成31年/令和元年度は、前年度に作製した二倍体、三倍体、四倍体酵母を用いて、相同組換えDNA修復にかかる各主要遺伝子の発現量を評価する。ハウスキーピング遺伝子の発現量を基準とした相対定量を実施して、各倍数体間においてそれらの数値を比較する。また相同組換えDNA修復にかかる各主要遺伝子の発現量を人為的に変動させるための一倍体酵母株を掛け合わせて、ガラクトースにより各遺伝子の発現量調節が可能な二倍体、三倍体、四倍体の菌株を作製する。
また最終年度は、ガラクトース濃度を変化させて、その前年度に作製した各倍数体の酵母を培養し、各DNA修復エラー（ヘテロ接合性の消失、染色体喪失）の発生頻度を評価する。さらに各濃度における各主要遺伝子の発現量を定量することで、全DNA修復エラー（ヘテロ接合性の消失および染色体喪失の合計）を最小化する条件を特定し、高次倍数体育種におけるゲノム安定性の向上につなげていく。
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| Causes of Carryover |
平成30年度は本研究課題の基盤となるDNA複製エラー検出手法を確立するため、その試行錯誤において多くの物品費（消耗品）を使用することが想定されたが、計画が順調に進行したため、所属機関の運営費交付金からの支出のみで研究を遂行することが可能であった。次年度の計画では遺伝子発現解析が予定されており、そこで想定外の条件検討等が発生した場合は、その費用が高額になることが容易に予想される。令和元年度は研究補助員（6人月）を雇用して計画を遂行する予定であるが、計画の実現性を高めるために人件費への充当や物品費の補強等を含め、研究進行状況に応じて柔軟な執行に努める予定である。
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