2018 Fiscal Year Research-status Report
コリネ型細菌による転写後制御によるアミノ酸生産への影響
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18K05425
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| Research Institution | Research Institute of Innovative Technology for the Earth |
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Principal Investigator |
田中 裕也 公益財団法人地球環境産業技術研究機構, その他部局等, 主任研究員 (40754247)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | コリネ型細菌 / アミノ酸生産 / 転写後制御 / RNA分解 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではアミノ酸等の工業生産に広く利用されるコリネ型細菌について、RNA分解制御を中心とした転写後制御の研究を進めることで、アミノ酸代謝系遺伝子の発現制御を解明し、その知見を利用したアミノ酸生産向上を検討していくことを目標としている。今年度はリジン酸生産に関わるdapAとゲノム上でdapA遺伝子の直後に存在するRNA分解酵素rnjの遺伝子オペロン（dapA-rnjオペロン）の発現解析を行った。解析の結果、RNase EGをコードするrneG破壊株で発現上昇が見られたこと、dapA-rnjオペロン全長産物が特に増加したことから、RNase EGによるdapA-rnjオペロンの切断があることが示された。RNA安定性の検討から、RNase EGによる切断がdapA、rnjそれぞれのmRNA分解制御に関わることが示された。さらにRNase Jの活性部位に変異を導入した株を作井し、変異がdapA-rnjオペロンの転写産物の発現に及ぼす影響を調べた。変異株の解析結果から、dapA-rnjオペロンはRNase JによるmRNA分解を介した自己制御されていることを示すことが出来、リジン酸生産経路がRNase EG、RNase Jという2種のRNaseによる転写後制御を受けていることを明らかにした。
またrnj遺伝子破壊株の解析から、RNAシャペロンであるCspAもmRNA分解の標的であることが判明した。cspA mRNAは通常33℃の培養条件では速やかに分解されるが、この分解の主役がRNase Jであることを示した。さらに、相同性を持つcspA2 mRNAはrnj破壊の影響が小さいことから、それぞれ異なる分解制御を受けていることを示すことが出来た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究テーマでは、アミノ酸生合成遺伝子の発現に対する転写開始後発現制御について明らかとすること、RNase Jをコードするrnj遺伝子等について転写後制御因子の発現制御解析を行うこと、そしてこれらの知見をもとにした転写後制御調節によるアミノ酸生産向上を目指している。今年度はこのうち、リジン生合成遺伝子をコードするdapAの転写後制御の解析を主に行った。
これまでにdapA-rnj遺伝子クラスターについては主にrnj遺伝子についての発現解析を行っており、レポーター遺伝子の解析等からRNase J自身による自己制御を示唆する結果を得ている。今回dapA、rnj両遺伝子のプローブを用いたノーザンブロット解析からdapA-rnjがオペロンとして発現されていることを確認した。dapA遺伝子についてRNase Jによる分解制御を解析するため、RNase Jの活性部位に変異を導入した。この変異型rnj株ではdapAの発現がおよそ2倍上昇していた。また主要RNaseであるRNase EGをコードするrneG遺伝子の破壊株でもdapAの発現の上昇を観察した。ノーザンブロット解析から、dapA遺伝子内部にRNase EGの切断部位が存在することを示唆する結果も得られた。リファンピシン添加による新規mRNA合成阻害時のdapA mRNA量の経時的な計測から、RNase J、RNase EGの遺伝子破壊株でdapA mRNAが野生型よりも安定化していることを確認した。
以上の結果からdapA遺伝子の発現が転写開始後に制御されていることを明らかにした。2018年度当初に計画していたアミノ酸合成遺伝子の発現に対する転写開始後制御の解析について当初の予定通り順調に進捗することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
2018年度の研究の結果、dapAの転写後制御について詳細なデータを得ることができた。今後はdapA以外の遺伝子発現についても転写後制御に着目した解析を進める。
アミノ酸生合成遺伝子の発現に対する転写発現制御解析について。次年度以降はdapA以外のリジン生合成遺伝子にも対象を拡げる。この際、mRNAレベルの発現解析だけでなく、酵素活性測定等によるタンパク質レベルでの発現解析も行う。以上の実験は対数増殖培養時、アミノ酸飢餓時、リジン等のアミノ酸生産時等様々な培養条件で検討を行う。
次に、転写後発現制御因子の制御について。これまでの解析からrnj遺伝子の発現が自身およびRNase EGによるmRNA分解段階での制御下にあることを明らかにしてきた。これがmRNA発現レベルだけでなく、タンパク質発現にも反映されていることを検討するため、抗RNase J抗体を作成し、ウエスタンブロッティングによる発現解析も行う。
次にRNase Jと同様にRNA代謝に主要な役割を果たしているRNase EGについても同様な転写後制御が存在するか解析をする。具体的にはrnj遺伝子破壊がrneG発現に及ぼす影響を解析する。さらにRNase EGの活性部位に変異を導入した株を構築し、活性低下がrneG自身の発現にどのような影響を及ぼすのか、mRNA代謝に焦点を絞り解析を進めていく。
転写開始後制御調節によるアミノ酸生産向上について。アミノ酸生産株にrnj変異を導入した株の構築を行う。アミノ酸生合成遺伝子の発現を野生株、RNase遺伝子破壊株など比較し遺伝子発現量の解析検討を行う。
次年度では上記の研究を行い、コリネ型細菌におけるアミノ酸生合成遺伝子の転写後制御について2018年度までの研究からさらに発展させていく方針である。
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| Causes of Carryover |
当該年度は次年度以降の研究ための準備研究が多く、使用額に余裕が生じた。次年度からはRNA代謝に関わる因子の探索が本格的化するため、使用額の増加が見込まれる。
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