2020 Fiscal Year Research-status Report
コリネ型細菌による転写後制御によるアミノ酸生産への影響
| Project/Area Number |
18K05425
|
|---|
| Research Institution | Research Institute of Innovative Technology for the Earth |
|---|
Principal Investigator |
田中 裕也 公益財団法人地球環境産業技術研究機構, その他部局等, 主任研究員 (40754247)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | コリネ型細菌 / リジン生産 / 転写後制御 / RNase |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではアミノ酸等の工業生産に広く利用されるコリネ型細菌について、RNA分解制御を中心とした転写後制御の研究を進めることでアミノ酸代謝系遺伝子の発現制御を解明し、その知見を利用しアミノ酸生産向上を検討していくことを目標としている。
昨年度に引き続き、リジン酸生産に関わる遺伝子群およびリジン生合成遺伝子dapAとオペロンを構成するRNA分解酵素(RNase)をコードするrnj遺伝子の発現解析を行った。rnj遺伝子の転写後制御解析では、rnj mRNAの5’末端解析によりRNase E/Gに依存して生成される5’末端が存在すること、RNase J変異株では野生株と比較して複数の5’末端が存在することが判明した。後者の結果はRNase Jがrnj mRNAの5’末端を認識し、エキソヌクレアーゼ活性により分解していることを示唆する結果であると考えられる。また野生株、RNase破壊株共にrnj上流に位置するdapAの翻訳開始部位に5’末端が見いだされた。dapAにはプロモーターの存在を示唆するデータも報告されていることからdapA-rnjのオペロンがリーダーレスmRNAとして転写されている可能性が考えられる。
リジン生合成遺伝子の発現解析からは、dapA以外にも複数の遺伝子がrnj破壊株で発現上昇することが判明した。これらの遺伝子産物mRNAはrnj破壊によって安定性も向上しており、RNase Jによって分解制御を受けている可能性が高いと考えられる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度はrnjの発現解析、リジン生合成遺伝子の転写後制御解析を主に行った。rnjの転写後制御についてはRNaseによる切断点の手がかりを得る目的で、rnj mRNAの5’末端を5’-RACE法により決定した。その結果、野生株では主な5’末端としてrnj遺伝子の翻訳開始コドンから908bp上流と219bp上流が決定された。このうち908bp上流はrnjの上流に位置するdapAの翻訳開始コドンと一致しており、Kalinowsjki等の研究からもここが転写開始点と推定される（BMC Genomics. 2013 Dec 17;14:888.）。rnj変異株では野生株で検出された5’末端に加えさらに複数の末端が検出された。これらの転写産物末端はRNase Jのエキソヌクレアーゼ活性により分解されていると考えられる。rneG破壊株では908bp上流は検出されたが、219bp上流の末端は検出されなかった。この結果から219bp上流末端はRNAse E/Gによる切断活性に依存して生成されると考えられる。
リジン生合成遺伝子におけるRNase J、RNase E/Gの影響について、これまでrnjとオペロンを形成するdapAがRNase Jによって転写後制御を受けることを示した。今年度はdapA以外のリジン生合成遺伝子群についてRNA分解段階の制御解析を行った。RNaseの遺伝子破壊株としてrnj、rneGに加えrnc、rnr、rnZ、pnp、ybeYを用意し、野生株と比較した。その結果rnj、rneG破壊株で2倍以上の発現上昇が観察された。特にdapA、dapD、dapC、lysAの発現はrnj破壊株で4倍以上上昇しており、これらはRNase Jの標的であると考えられる。興味深いことにリジン生合成経路のうちジアミノピメリン酸脱水素酵に関してはrnj破壊の影響が見られなかった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
2020年度の研究の結果、RNase Jの発現制御機構の解析が進み、リジン生合成遺伝子群に対するRNase J、RNAse E/Gの関与も明らかとなった。
アミノ酸生合成遺伝子の発現に対する転写発現制御解析について、次年度以降はリジン生産株で転写後制御がどの程度行われているのか解析を進める。この際、mRNAレベルの発現解析だけでなく、酵素活性測定等によるタンパク質レベルでの発現解析も検討する。また、リジン生合成遺伝子に加え、排出タンパクの発現解析も予定している。
次に、RNaseの制御に関し、主要RNAseでありリジン生合成遺伝子の発現にも影響するRNase E/Gについても発現制御解析を行う。具体的にはrnj遺伝子破壊がrneG発現に及ぼす影響を解析する。さらにRNase E/Gの活性部位に変異を導入した株を構築し、活性低下がrneG自身の発現にどのような影響を及ぼすのか解析を進めていく。またRNaseの発現だけでなく活性制御を行う因子を探索する目的でRNase JあるいはRNase E/Gと相互作用するタンパク質の探索を行う。
転写開始後制御調節によるアミノ酸生産向上について、アミノ酸生産株にrnj変異を導入した株の構築を行う。アミノ酸生合成遺伝子の発現を野生株、RNase遺伝子破壊株など比較し遺伝子発現量の解析検討を行う。
次年度では上記の研究を行い、コリネ型細菌におけるアミノ酸生合成遺伝子の転写後制御について2020年度までの研究からさらに発展させていく方針である。
|
| Causes of Carryover |
次世代シークエンスを利用した解析を予定しており、次年度使用額が必要である。
|
