2018 Fiscal Year Research-status Report
無細胞翻訳系を用いた天然ゴム生合成酵素複合体の再構築手法の開発
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18K05428
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
小島 幸治 東北大学, 工学研究科, 学術研究員 (80457382)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 天然ゴム / パラゴムノキ / 無細胞翻訳 / 酵素複合体の再構築 / イソプレノイド / ラテックス / ゴム粒子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、本申請者の研究グループは小麦胚芽由来の無細胞翻訳系を用いて天然ゴム合成関連タンパク質（HRT1-REF-HRBP）を合成し、天然ゴム合成の場となるゴム粒子上にそれぞれ再構成させることに成功した。この手法は、これまで成し得なかった再構成された酵素による天然ゴムの試験管内合成を可能にし、天然ゴム合成に必要な酵素複合体の構造モデル（山下ら 2016）の提唱に至った。これらの研究結果を踏まえ、本研究では、遺伝子改変が容易な原核生物（大腸菌）由来の無細胞翻訳系でも天然ゴムの生合成が可能であることを確かめ、原核生物の無細胞翻訳系で天然ゴム合成酵素複合体再構築の条件検討を行った。
平成30年度は、これまでの申請者の研究グループによる小麦胚芽無細胞翻訳系で得た解析結果が、大腸菌無細胞翻訳系を用いても再現できるか確かめた。具体的には、小麦の実験系を用いた解析手法と同様に、パラゴムノキのラテックスから調製したゴム粒子を原核型の翻訳装置で構成される大腸菌翻訳系に添加し、天然ゴム合成関連タンパク質の合成を行った。その結果、タンパク質合成後の産物がゴム粒子に組み込まれたことから、ゴム粒子上におけるHRT1-REF-HRBPの再構築が可能であることが示唆された。また、この産物を用いてゴム合成アッセイを行い、天然ゴムサイズに相当するポリマー伸長活性を観察することができた。しかしながら、ゴム粒子上に合成した3因子のタンパク質の蓄積量は、小麦胚芽無細胞翻訳系で得られた収量と比較してかなり少ないものであった。その結果、ゴム合成活性も低いものとなった。現在までに、ゴム合成活性を高めるための条件検討を進めるなかで、不安定で凝集化しやすいゴム粒子の安定化に寄与する反応液組成を見つけた。今後も、天然ゴム合成因子の合成量の増大と、その産物となる酵素複合体の天然ゴム合成活性の向上につながる条件検討を続けていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．大腸菌無細胞翻訳系について、これは既に実験手法が確立されている系ではあるが、天然ゴム合成酵素複合体タンパク質の翻訳に有効かどうかは不明であった。本年度の研究により、原核生物由来の翻訳装置でもタンパク質の合成が可能で、ゴム合成活性を保持する複合体構築が可能であることがわかった。この結果は、パラゴムノキの天然ゴム合成酵素複合体遺伝子の翻訳過程およびゴム粒子の組み込み過程において真核生物由来のリボソームや制御因子に依存しない様式で進行できることを明らかにした。さらには、HRT1は単独ではゴム合成活性を示さないが、ゴム粒子上に導入することで活性を示すことを改めて確かめることができた。しかしながら、当初の予想通りタンパク質の収量とその産物の活性が低いため、さらなる条件検討と改善を続けることが必要である。そのなかで、初年度おける「無細胞翻訳系の反応液組成とゴム粒子の安定性との相関」について行った条件検討からえられた知見は、今後の解析の進展につながるものであると考えている。
２．パラゴムノキのラテックスから調製されたゴム粒子の状態が再構成実験に大きな影響を及ぼすことがわかってきた。ゴム粒子の原材料のパラゴムノキのラテックスの状態は採取時期によって変化し、それに伴ってゴム粒子の不安定化の要因となる「凝集」の発生頻度も変化する。この性質の影響を受け、ゴム合成活性を安定して得られない時期があり、実験計画が停滞した時期があった。そこで、安定したゴム粒子の確保が今後の実験計画を進めるために重要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
【項目１】天然ゴム合成酵素複合体の合成量と安定化の向上を目指す
大腸菌の無細胞翻訳系は、小麦胚芽の系と比較して翻訳効率が低い。また、ゴム合成酵素の特性にあわせた大腸菌無細胞翻訳系の反応条件検討も必要とされる。初年度（平成30年度）では、「S30画分を調製するバッファーの検討」や「翻訳反応液に対する界面活性剤の添加」がゴム粒子の安定化の向上に有効であることがわかった。今年度（平成31年度）においては、天然ゴム合成関連タンパク質が新規に合成され、ゴム粒子に組み込まれる過程において、分子シャペロン（GroESLやDnaKJ/GrpE）の添加が天然ゴム合成活性の向上に対して有効か検証する。また、リボソームを細胞質から細胞膜へ移行させ、膜タンパク質合成の仲介役として働いている大腸菌のSRP-FtsY、Secファミリー、CspEの中から翻訳系に組み込む。その結果、翻訳系の律速段階が解消される可能性を視野に入れて解析し、考察する。
【項目２】天然ゴム合成酵素関連タンパク質（HRT1-REF-HRBP）の相互作用と機能相関
初年度（平成30年度）の解析において、ゴム粒子に対して、3つの天然ゴム合成酵素関連タンパク質（HRT1-REF-HRBP）がそれぞれ大腸菌無細胞翻訳系を介して導入されたことが確かめられた。しかしながら、3つの因子が複合体を形成して存在しているかについて実証をすることができなかった。そこで、各因子の相互作用を確かめることに加え、相互作用部位の同定や機能相関について解析をおこなう。
以上の【項目１と２】の解析から、大腸菌無細胞翻訳系のタンパク質合成量の向上と酵素複合体の安定化に対して正の効果が得られれば、次年度以降に予定をしている酵素複合体の単離精製へ向けた解析が可能になる。
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| Causes of Carryover |
平成30年度の研究において、大腸菌無細胞翻訳系の実験のスタートアップは、所属研究室の試薬と器具や備品で実行が可能であった。また、研究が順調に進行し、試行回数が当初の予定よりも少なく進行することができたため、使用額を低く抑えることできた。
平成31年度は、大腸菌無細胞翻訳系のさらなる条件検討の試行回数が多くなることが予想される。さらには、遺伝子コンストラクトの作成および精製タンパク質の調製を行う際に新規に購入する消耗品が必要となるので、そこで、平成30年度の差額をこれらの解析に使用する。その内訳は、PCR酵素などの遺伝子組み換え試薬、イオン交換カラム、一般試薬、一般消耗品(チップ、シャーレなど)である。また、大腸菌翻訳系の比較対照としてコムギ無細胞翻訳系キットを消耗品として購入する。
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[Presentation] Interaction and its functional correlation of factors constituting the biosynthetic machinery of natural rubber from Hevea brasiliensis2019
Author(s)
Kouji Kojima, Makoto Yamaguchi, Tomoki Ishii, Miki Suenaga-Hiromori, Toshiyuki Waki, Satoshi Yamashita, Yuzuru Tozawa, Haruhiko Yamaguchi, Yukino Miyagi-Inoue, Kazuhisa Fushihara, Toru Nakayama, Seiji Takahashi
Organizer
Japan-Taiwan Plant Biology 2019 (JTPB2019)、Nagoya Univ. Nagoya, Japan
Int'l Joint Research / Invited
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[Presentation] In vitro natural rubber biosynthesis by prenyltransferases introduced on rubber particles from Hevea brasiliensis2018
Author(s)
Tomoki Ishii, Miki Suenaga-Hiromiri, Satoshi Yamashita, Fumihiro Yanbe, Toshiyuki Waki, Kouji Kojima, Haruhiko Yamaguchi, Yukino Miyagi-Inoue, Kazuhisa Fushihara
Organizer
23th International Symposium on Plant Lipids (ISPL2018)、Osanbashi-Hall, Yokohama, Japan
Int'l Joint Research
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