2019 Fiscal Year Research-status Report
無細胞翻訳系を用いた天然ゴム生合成酵素複合体の再構築手法の開発
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18K05428
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
小島 幸治 東北大学, 工学研究科, 特任助教 (80457382)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 天然ゴム / パラゴムノキ / 無細胞翻訳 / 酵素複合体の再構築 / イソプレノイド / ラテックス / ゴム粒子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者の所属している研究グループは、小麦胚芽から調製された無細胞翻訳系を用いた解析結果から、シスプレニルトランスフェラーゼ（cPT）がパラゴムノキのラテックスから調製したゴム粒子に対して適切に組み込まれるステップは、天然ゴム合成活性の発現において重要な役割を果たしていることを明らかにした（山下ら2016）。さらには、ゴム粒子のプロテオミクス解析を行い、① 触媒本体のcPTの役割を担うHRT1/HRT2、② HRT1の膜上での安定化に寄与し触媒活性を持たないHRT1-REF bridging protein (HRBP)、③ ゴム粒子の安定化を担うREFを同定した。さらに、HRT1-HRBP-REFを共発現させてゴム粒子に組み込み再構成させた結果、天然ゴム合成活性を安定させる効果が得られた。これらの発見は、天然ゴムの人工合成方法の確立にむけて大きな進展を与えるものとなった。そこで、本研究の初年度において、原核生物の大腸菌で無細胞翻訳系を調製し同様な試験管内合成行っても、これまでの真核生物由来の細胞内成分を含む小麦胚芽無細胞翻訳系で得た解析結果が再現できることを確かめることができた。これらの結果から、天然ゴム合成酵素複合体の合成およびゴム粒子上への再構成には、真核生物由来の特別な因子に依存せずに行うことができることがわかった。本年度においては、ゴム合成に関わるタンパク質のタンパク質レベルにおける相互作用とその機能、および作用している領域の探索を行った。ゴム合成酵素を担うパラゴムノキのHRT1と、そのパートナータンパク質HRBPとREFとの間で相互作用することがすでにわかっている。これらの部分的な断片を構築し、どの領域が相互作用に関与するか確かめた結果から、相互作用部位の存在に加えて、相互作用とゴム合成活性との間に正の相関関係があることを確認することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
【課題１：大腸菌無細胞翻訳系を用いたゴム合成酵素の再構築】
大腸菌無細胞翻訳系を用いて、天然ゴム合成酵素の再構成実験を進めてきた。これらの結果を小麦胚芽の実験系から得られた結果と比較したところ、タンパク質の合成量は低いが、タンパク質当たりのゴム合成活性は十分得られていると判断していた。大腸菌系においても、より安定した活性が得られる条件が得られるようにラテックスから得られるゴム粒子の分画作業を数度繰り返した。昨年度においては、ラテックス採取時期について焦点を絞り検討を行ったが改善は得られなかった。本年度においては、分画条件を見直すことによりゴム粒子単体で得られる活性は高いものの、cPTを導入したゴム粒子においても高い活性の亢進効果が得られるように改善された。課題１については上記の理由から進捗はやや遅れていると考えれれる。しかしながら、現段階における成果をまとめ、近日中に論文投稿にむけた準備を始めている。
【課題２：天然ゴム合成酵素関連タンパク質（HRT1-REF-HRBP）の相互作用と機能相関】
研究業績の概要においても述べたように、ゴム合成に関わる酵素複合体を構成するタンパク質相互作用とゴム合成活性との間で正の相関があることを明らかにした。このように、HRT1-HRBP-REF間の相互作用が、酵素の新規合成量の向上と、再構築における酵素複合体の安定化に効果が期待できるようになってきた。これらの結果は、次年度以降に予定をしている酵素複合体の単離精製へ向けた解析につながるものと考えている。課題２に関して、進捗は順調であると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
複合体単離にむけた条件検討
今年度までに、HRT1とそのパートナータンパク質の相互作用と部位について確認をすることができた。本年度においては、HRT1とHRBP、REFが共存して検出されるかを確かめる。
これらを明らかにするためにゴム粒子に存在しているタンパク質複合体の単離方法を検討する。【実験１】タグを付加したcPTを無細胞翻訳系で発現させ、産物を免疫沈澱法により回収し、LC-MS/MSを用いてタンパク質組成を調べる。【実験２】脂質で構成された膜を含んだ状態で複合体を単離する方法を検討し、同様にLC-MS/MSを用いてタンパク質同定を行う。HRT1とそのパートナータンパク質としてHRBPとREFが共存しているならば、酵素の構築からゴム合成活性の発現に至るまで、それぞれの相互作用の重要性が明らかになる。一方で、予想に反してそれぞれが酵素複合体として存在していないならば、各因子の相互作用はcPTの新規合成とゴム粒子への組み込みにおいてのみ機能し、酵素が成熟型に移行する際に相互作用が解消されると理解することができる。
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| Causes of Carryover |
平成30年度の研究において、大腸菌無細胞翻訳系の実験のスタートアップは、所属研究室の試薬と器具や備品で実行が可能であった。また、研究が順調に進行し、試行回数が当初の予定よりも少なく進行することができたため、使用額を低く抑えることできた。令和元年度は、大腸菌無細胞翻訳系のさらなる条件検討の試行回数が多くなることが予想され、さらには、遺伝子コンストラクトの作成および精製タンパク質の調製を行う際に新規に購入する消耗品が必要となるので、そこで、平成30年度の差額をこれらの解析に使用した。その内訳は、PCR酵素などの遺伝子組み換え試薬、イオン交換カラム、一般試薬、一般消耗品(チップ、シャーレなど)であった。また、大腸菌翻訳系の比較対照としてコムギ無細胞翻訳系キットを消耗品として購入した。令和元年度においては、光合成微生物を用いた複合体再構築の検討を計画していたが、方針を変更した。この理由から以前の研究計画で購入する予定であった光合成微生物の生育や組み替え体保管に必要な人工気象機の購入が見送られた。その結果生じた差額を令和二年度の予算に充てることにした。また、研究代表者は令和二年度に崇城大学に異動した。実験のセットアップや学会・研究会への参加を行うための費用として、前年度に生じた差額の予算を使用する予定である。
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