2021 Fiscal Year Annual Research Report
Production of natural rubber in vitro from reconstituted-rubber synthase complex on rubber particles with Escherichia coli cell-free translation system
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18K05428
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| Research Institution | Sojo University |
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Principal Investigator |
小島 幸治 崇城大学, 生物生命学部, 准教授 (80457382)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 天然ゴム / パラゴムノキ / 無細胞翻訳 / 酵素複合体の再構築 / イソプレノイド / ラテックス / ゴム粒子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、天然ゴム合成酵素の一因子であるイソプレン重合酵素（HRT1）が、原核生物（大腸菌）で調製した無細胞翻訳系で、天然ゴムサイズのポリマー合成活性をもつ酵素複合体として再構築できることを確かめ、さらに大腸菌翻訳系の反応組成を改変し、真核型の翻訳系（小麦胚芽から調製した無細胞翻訳系）から作られる複合体の再構築と天然ゴム合成能を目指し、検証を行ってきた。①前年度末（令和3年3月）から、各実験の工程について確認し、論文完成に向けた作業を始めた。再実験を行い、結果についてディスカッションし、天然ゴム合成酵素複合体の再構築には真核生物由来の特別な因子を介さず、原核型の翻訳装置でも可能であることを確かめた。合成の基盤となるパラゴムノキ由来のラテックスからのゴム粒子調製も繰り返し行い、再現性を確認した。②アッセイ系の検証において、天然ゴム合成において主要酵素HRT1のアミノ酸配列について変異や欠失が見つかり、データベース上の配列に合わせたHRT1で再試験したデータを比較し問題が無いことを確かめた。さらには、発現量の確認、天然ゴム合成の場となるゴム粒子への組み込み、酵素活性（基質の組み込み量、イソプレン鎖長の測定）など再試験のデータを反映させた論文の内容に修正した。③天然ゴム合成酵素関連因子の相互作用の結果を受けて、特殊な化学合成ポリマーを用いてゴム粒子の膜成分を細分化・精製し、質量分析計で再構成に関与する未知因子の同定を試みたが、既知因子（HRT1-HRBP-REF）以外の同定に至らなかった。共同研究者の研究からディスク状膜の人工合成技術開発が進行し、酵素複合体の再構築に成功している。再構成に特別なタンパク質因子が不要で、このような人工膜でもポリイソプレン合成が可能になるので、本課題の成果が長鎖イソプレンポリマーの人工合成に向けた技術開発につながることが期待される。
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