2018 Fiscal Year Research-status Report
反応中間体の構造解析によるマルチ銅オキシダーゼの酸素還元機構の解明と応用
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18K05432
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
片岡 邦重 金沢大学, 物質化学系, 教授 (40252712)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山下 哲 金沢大学, 物質化学系, 准教授 (70361186)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | マルチ銅オキシターゼ / 構造解析 / 反応機構 / 指向進化 / 中性子線構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マルチ銅オキシダーゼ（MCO）は，分子内にタイプⅠ, Ⅱ, Ⅲ銅に分類される３種，計４個の酵素活性に必須な銅イオンを含む金属酵素で，タイプⅠ銅で基質を酸化した電子を用いて，タイプⅡ, Ⅲ銅からなる三核銅部位で酸素を４電子還元し水を生成する反応を触媒する。MCOは様々な基質を電子供与体として利用できるうえ生成物が水であるため，パルプ及び繊維の漂白・脱色，染色，有害物質の分解処理，臨床検査試薬など多岐にわたり産業利用されている。また，MCOは電極からも電子を受容し，酸素を最終受容体とするため，生物燃料電池のカソード電極用酵素として大きな注目を集めている。MCOは，系外に活性酸素種を放出することなく分子状酸素を水にまで４電子還元できるが，その反応機構は明らかではない。本研究では，MCOの一種である大腸菌の一価銅酸化酵素CueOを対象に，X線結晶構造解析，中性子線構造解析による酸素還元反応中間体の構造解析を目指している。また，進化分子工学的手法を用いて酸素還元中心近傍へ変異を導入することにより，酸素還元反応の直接制御技術を得ることも目的としている。
本研究初年度である平成30年度では，反応中間体の構造解析に使用できる良質な試料結晶を得るため，野生型CueOのX線構造データでゆらぎの大きなドメイン３のタワーループ部への変異導入を行った。これまでにタワーループ部を部分切除した３種類の変異型CueOを作製し，それらの発現に成功した。
また，Error-prone PCR法によるランダム変異導入を用いて作製した変異型CueOライブラリーを対象に，酵素活性の増大を指標にスクリーリングしたところ，ABTS酸化活性が８倍に増大した変異体Gly304Glu，４倍に増大したLeu502Valを得ることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では，中性子線構造解析の手法を用いてMCO反応中間体の水素原子座標を決定し，プロトネーションによる酸素還元反応の全容を解明することを目標の一つとしている。中性子線構造解析に使用できる良質大型結晶の取得のため，不安定なループ構造部分をトリミングした変異型酵素の作製に成功したが，結晶化条件の検討は次年度に持ち越しとなっている。また，ループ短縮変異体をベースに，タイプⅠ銅配位Cys500とプロトンドナーGlu506を，それぞれSer, Glnに置換し，発現状態で酸素の２電子還元反応中間体を取る二重変異を導入する必要がある。
進化分子工学的手法を用いて酸素還元三核銅中心近傍へ変異を導入する研究では，これまでに報告のない部位へのアミノ酸置換が活性を増大させることを明らかにしたが，得られた変異体の活性増大の原因は電子受容部位であるタイプⅠ銅部位の電位変化であることが明らかになった。未だ三核銅中心近傍のアミノ酸置換で酵素活性が増大する変異体は得られていないため，更なるスクリーニングが必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和元年度では，前年度に得た３種のループ短縮変異体をベースに，Cys500Ser/Glu506Glnの二重変異を導入し，結晶化条件の検討を行う。重水を用いた結晶作製の前に，軽水中で結晶を得てX線構造解析により結晶性の向上を確認したい。従来の野生型CueOをベースとするCys500Ser/Glu506Gln二重変異体については，引き続き大型結晶の作製条件の検討を行う。またCueOに加え，最近大腸菌での発現に成功したビリルビンオキシダーゼを標的に結晶化と構造解析を行い，酵母で発現した同酵素と結晶性の比較を行う予定である。
進化分子工学を用いて三核銅部位へ変異を導入し活性の増大した変異体を作製する研究については，Error-prone PCR法によるランダム変異導入ライブラリーの作製とスクリーニングを継続して実施し，目的の変異体の取得を目指す。ビリルビンオキシダーゼについても同時平行してランダム変異導入を行い，２つの酵素を用いることで，できるだけ早く三核銅部位への変異導入を目指す。
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| Causes of Carryover |
当初計画していたよりも物品費を安く抑えることができたため未使用額が発生したが，引き続き，次年度以降も物品購入に使用する。
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Research Products
(6 results)
