2018 Fiscal Year Research-status Report
植物細胞内におけるビタミンB2の代謝調節機構の包括的解明
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18K05439
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
小川 貴央 島根大学, 学術研究院農生命科学系, 准教授 (80603802)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ビタミンB2 / リボフラビン / 輸送体 / 転写因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ビタミンB2であるリボフラビンを前駆体とするFADやFMNは、生物のあらゆる生理機能の根幹に関わる補酵素であるため、細胞内レベルは恒常的に維持されている。植物においてリボフラビンは葉緑体のみで合成され、各オルガネラに輸送された後にFADやFMNが合成されると考えられる。また、それらフラビン化合物の分解系も複数存在している。しかし、その合成/分解系制御の分子機構やオルガネラ間の輸送機構については全く不明である。そこで我々は、シロイヌナズナにおけるフラビン化合物レベルの恒常性維持に関わる新規因子を同定するために、トランスクリプトーム解析により細胞内FADレベル変化に応答して発現変動する転写因子および輸送体をコードする遺伝子をそれぞれ47個、17個同定した。47個の転写因子をコードする遺伝子のうち、24種類の遺伝子破壊株を単離し、得られた遺伝子破壊株の細胞内フラビン化合物レベルについてLC-MS/MSを用いて解析した。その結果、24種類の遺伝子破壊株のうち、2種類の遺伝子破壊株におけるフラビン化合物レベルは、野生株と比較して著しく減少していた。したがって、これら2種類の転写因子は植物におけるフラビン化合物レベルの調節に関与する新規因子である可能性が示唆された。一方、17個の輸送体関連遺伝子については、RF生合成遺伝子を欠損したRF要求性酵母を用いた相補試験を行なった。RF要求性酵母は外部から高濃度のフラビン化合物を添加しなければ生育できないが、1種類の輸送体関連遺伝子を導入したRF要求性酵母は、低濃度のRF添加培地でも生育可能であった。したがって、本輸送体関連遺伝子が植物のフラビン化合物輸送に関連する新規因子であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1 フラビン化合物輸送体の同定と生理機能解析
酵母のRF要求株を作製し、トランスクリプトーム解析により同定した17個の輸送体関連遺伝子 (FRTPs)およびそのホモログなどの候補遺伝子を発現させ、低濃度のフラビン化合物を含む培地における生育の可否を判定することで、フラビン化合物輸送体のスクリーニングを試みた。その結果、FRTP4遺伝子導入株のみが低濃度RF添加培地で生育可能であったことから、FRTP4がシロイヌナズナのフラビン化合物輸送に関わる新規因子であることが示唆された。さらに、FRTPsに含まれていたPurine permease (PUP)にも注目し、シロイヌナズナの21種類のPUPについても同様の酵母を用いた相補試験を行なった。その結果、21種類のPUPのうち、PUP-a導入株が低濃度RF添加培地において生育可能であったことから、PUP-aもまた植物のフラビン化合物輸送に関与することが示唆された。
2 フラビン応答性転写因子 (FRTFs)がフラビン化合物代謝系制御に果たす役割
FRTFsとフラビン代謝系の制御との関連性を明らかにするために、各FRTFのシロイヌナズナ遺伝子破壊株を単離した。これら遺伝子破壊株のフラビン化合物量を定量した結果、24種類の遺伝子破壊株のうち、KO-frtf11および19株の細胞内フラビン化合物レベルは野生株と比較して顕著に減少していた。さらに、両株における既知のフラビン合成系遺伝子の発現量を解析した結果、野生株と比較してKO-frtf11株ではRF合成に関わるAtRibA1、COS1およびRS、KO-frtf19株ではAtRibA1、PyrR、PyrDおよびCOS1の発現量が顕著に低下していた。したがって、FRTF11および19は、植物細胞内フラビン化合物レベルの調節に関与することが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
現段階では大きな遅れもなく、研究計画通りに進捗している。したがって、今後は当初の予定通り以下のように研究を進めていく。
1 フラビン化合物輸送体の同定と生理機能解析
これまでに同定したフラビン輸送体候補遺伝子FRTP4とPUP-aの生理機能の解析を進める。蛍光タンパク質を用いた細胞内局在性の解析、プロモーターGUSを用いた組織特異的発現の解析、遺伝子破壊株の単離、過剰発現株の作出を進める。さらに、培養細胞系を用いたフラビン輸送活性の評価系の確立を試みる。
2 フラビン応答性転写因子 (FRTFs)がフラビン化合物代謝系制御に果たす役割
新規候補遺伝子であるFRTF11および19の破壊株に加え、過剰発現株の作出を進める。作出した遺伝子破壊株や過剰発現株を用いてトランスクリプトーム解析を行い、発現変動している遺伝子の探索を行い、FRTF11および19の下流遺伝子の探索を進める。
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| Causes of Carryover |
当初の計画では、平成30年度の予算により人工気象器LPH-411S（日本医化器械製作所製、\1,690,000）を購入する予定であったが、これは平成30年度の直接経費の交付内定額（\1,700,000）のほぼ全額に相当し、本設備の購入を取りやめたため。
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