2019 Fiscal Year Research-status Report
液胞アミノ酸輸送の全容解明に向けたPQループファミリートランスポーターの機能解析
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18K05440
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
河田 美幸 愛媛大学, 農学研究科, 准教授 (10454498)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 液胞 / アミノ酸輸送 / トランスポーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は単離液胞膜小胞を用いたYpq2によるアミノ酸輸送活性の解析を進め、長年実体が不明であった、液胞膜を介したアルギニン／ヒスチジン交換輸送活性の実体がYpq2であることを明らかにした。さらにYpq2はプロトン濃度勾配もしくはヒスチジン濃度勾配のいずれかに依存する2つの機構でアルギニン輸送に関わることが示唆され、保存された2か所のPQモチーフ中にあるP29およびP202残基は、これら両方の活性に必須の重要アミノ酸残基であることが分かった(Kawano-Kawada M. et al., Sci. Rep., 2019) 。しかしアルギニン欠乏培地における生存率については、野生株とYPQ2遺伝子破壊株（いずれもアルギニン合成酵素の遺伝子破壊株）の間にほとんど変化は見られなかった。したがって、液胞膜を介したアミノ酸交換輸送の生理的重要性を含め、in vivoにおけるYpq2の輸送機能についてはさらに解析が必要である。
また液胞PQループタンパク質の候補遺伝子が1種のみ存在する分裂酵母を対象として、生理機能解析を進めた。当該遺伝子産物については既に細胞膜局在のGPCRであるとの報告があるが、出芽酵母Ypq1～3とのアミノ酸配列相同性を基にした系統解析から、本遺伝子も液胞アミノ酸トランスポーターをコードする可能性が考えられた。本遺伝子産物は、GFP融合型として発現させると分裂酵母／出芽酵母いずれにおいても液胞膜に局在し、分裂酵母の遺伝子破壊株では液胞塩基性アミノ酸含量が大きく変動したことから、液胞膜を介したアミノ酸輸送能をもつことが示唆された。さらに、出芽酵母単離液胞膜小胞を用いた活性測定により、本遺伝子依存的に有意なアミノ酸取込み活性が検出された。以上の結果から分裂酵母液胞PQループタンパク質がアミノ酸輸送に関わることが強く示唆され、これらの結果について現在論文投稿中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
生化学的解析のためのYpq2精製法確立に向け、変異導入や遺伝子多重破壊により細胞膜局在型Ypq2変異体の作製を試みたが、目的酵母株の取得には至らなかった。そこで他生物種発現・精製系の構築を試みた。このうちYPQ2ホモログのYPQ1について、昆虫細胞Sf9を用いた安定過剰発現系ができたため、現在Ypq1活性測定系の構築を行っている。メタルアフィニティーカラムによるYpq1粗精製画分のリポソームへの組込みが可能であることを確認しており、次段階としてリジン取込み活性の測定を進めている。当初の計画を変更せざるを得なかった状況から進捗状況をやや遅れていると判断した。一方、PQループタンパク質の生理機能解明に向けて、分裂酵母液胞PQループタンパク質の候補遺伝子破壊株を作製した。本遺伝子をGFP融合型として出芽酵母および分裂酵母に発現させたところ、いずれも液胞膜に局在化することを見出した。遺伝子破壊株の液胞内アミノ酸量の定量により、分裂酵母における液胞への塩基性アミノ酸蓄積に本遺伝子産物が関与することが示唆された。また遺伝子破壊株への遺伝子再導入により、GFP融合型/非融合型いずれも活性を保持していることを確認しており、タグを利用した共免疫沈降実験が可能である。現在この分裂酵母株を用いた各種ストレス耐性試験および相互作用因子同定を進行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
精製PQループタンパク質を用いたプロテオリポソーム活性測定系による生化学的解析については、当初の目的変異株の取得が困難であったため、今後昆虫細胞による発現・精製系を基に実験を進める。本年度にYpq1に対して構築した精製・活性測定方法をYpq2とYpq3に順次適用することで、基質特異性／親和性やエネルギー共役の有無等、各々の輸送様式の違いを明らかにし、液胞PQループタンパク質によるアミノ酸輸送の分子機構解明を目指す。また、輸送における重要アミノ酸残基の特定について、植物糖輸送体SWEETの構造を基にしたモデルで基質認識に関わると推測されるYpq2のE170残基についてE170A置換変異体を作製し、上記精製・活性測定系を適用して輸送過程への関与を明らかにする。
また、PQループタンパク質の生理機能解明に向けて、分裂酵母液胞PQループタンパク質の遺伝子破壊株が有用であることが分かった。現在、窒素源や特定のアミノ酸に対する栄養飢餓などの各種ストレス耐性試験により、本遺伝子欠損により生育が抑制される条件を探索中である。この結果をもとに、過剰発現ライブラリーによる表現型相補遺伝子を探索し、PQループタンパク質の調節因子／相互作用因子等を同定する。同時に出芽酵母Ypq2と分裂酵母ホモログについて、スプリットGFP法を用いた相互作用因子特定をそれぞれ進める。同定した相互作用因子については破壊株を作製し、アミノ酸含量測定、胞子形成能評価などにより遺伝子欠損の影響を調べる。以上、精製トランスポータータンパク質を用いた輸送活性測定によるアミノ酸輸送機構の解明と、分裂酵母破壊株を用いたPQループタンパク質の機能解析、および相互作用因子特定により、液胞アミノ酸コンパートメント形成におけるPQループタンパク質の寄与とその調節機構について明らかにする。
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