2019 Fiscal Year Research-status Report
立体障害を導入した前駆体蛋白質を用いて捕捉した葉緑体蛋白質輸送装置の解析
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18K05441
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
秋田 充 愛媛大学, 農学研究科, 准教授 (50335890)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 葉緑体 / 蛋白質輸送 / 前駆体蛋白質 / 立体障害 / トランスロコン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
蛋白質は、翻訳後、適材適所に配置されることで、生命活動を支える。したがって、生体膜を介した蛋白質の輸送は蛋白質の適材適所にとって極めて重要な過程である。
植物の代謝の中心である葉緑体では、葉緑体蛋白質の大部分は、サイトゾルで前駆体蛋白質として翻訳され、葉緑体を囲む二重の包膜に存在する蛋白質輸送装置（トランスロコン）を利用して、独自のシステムにより葉緑体内に輸送される。しかし、その分子機構については未解明な点が多い。
本研究では、葉緑体への蛋白質輸送の解明を以下のストラテジーで行う。単離葉緑体を用いたin vitro蛋白質輸送実験に際し、立体障害を導入した前駆体蛋白質を用いることで、トランスロコンに前駆体蛋白質が捕捉された膜透過中間体を形成させる。中間体における前駆体蛋白質とトランスロコン構成因子との間の分子間相互作用の解析により、中間体を構成する因子を同定する。
当該年度も前年度に引き続き、立体障害の検討を行い、上記解析に有用な前駆体蛋白質の獲得に成功した。概要を以下に記す。
前年度獲得した立体障害を有する前駆体蛋白質は、葉緑体内に輸送されたことから、再度、前駆体蛋白質に導入する立体障害の検討を行った。試行錯誤の末、昨年度も利用を試みた自発的にイソペプチド結合を形成するSpyCatcher（SpyC）とSpyTag（SpyT）を再度検討することとした。前駆体蛋白質のC末端にSpyCを、N末端にSpyTを連結したストレプトアビジン単量体を同時に大腸菌内で過剰発現することで、ストレプトアビジン単量体を共有結合した前駆体蛋白質を獲得し、さらに、ストレプトアビジン単量体3分子とともに、再構成を試みたところ、ストレプトアビジン4量体を共有結合によって連結した前駆体蛋白質の獲得に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当該研究は、トランスロコンに前駆体蛋白質が捕捉された膜透過中間体を形成させることが、研究推進のために必要な重要条件となっているため、解析するに十分な性質をもった前駆体蛋白質の開発なくしては、次のステップに駒を進めることができない。当該年度も、試行錯誤を繰り返しながら、新規前駆体蛋白質の開発を進めてきたが、年度末になって、ようやく、使用に耐え得ることが期待される前駆体蛋白質が開発された。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度の年度末にようやく期待する前駆体蛋白質の開発に成功した。この前駆体蛋白質では、葉緑体移行シグナルであるトランジット配列（TP）と導入した立体障害との間が非常に短い。葉緑体蛋白質輸送の逐次的な相互作用を解析するためには、様々な長さのリンカーを挿入することで、この距離を延長する必要がある。したがって、本年度は、一連の前駆体蛋白質を作製し、これらを高濃度ATPを添加したin vitro葉緑体蛋白質輸送実験に供することで、膜透過中間体を形成させる。今回開発した前駆体蛋白質は、大腸菌で過剰発現時にビオチン化しているため、界面活性剤で可溶化した膜透過中間体をビオチンを利用することで精製し、膜透過中間体中で前駆体蛋白質と相互作用しているトランスロコン因子の同定を行う。また、in vitro葉緑体蛋白質輸送実験の際、低ATP濃度下で初期膜透過中間体が形成されるので、同様に中間体を可溶化し、精製後、構成因子の同定を目標とする。
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| Causes of Carryover |
残金が200円未満となることが判明したため、最終調整を行わなかったから。
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