Analysis of Chloroplastic Protein Import Machinery Capturing Precursors Carrying Steric Hindrance

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K05441
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 秋田 充 愛媛大学, 農学研究科, 准教授 (50335890)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 葉緑体 / 蛋白質輸送 / トランスロコン / 前駆体蛋白質 / 膜透過中間体 / 立体障害

Outline of Annual Research Achievements

蛋白質は、翻訳後、適材適所に配置されることで生命活動を支えるため、生体膜を介した蛋白質の輸送機構の解明は極めて重要な課題である。植物の代謝の中心である葉緑体では、蛋白質の大部分は、サイトゾルで前駆体蛋白質として翻訳され、葉緑体を囲む二重の包膜にある蛋白質輸送装置（トランスロコン）を利用して、独自のシステムで葉緑体内に輸送される。しかし、その分子機構は未解明な点が多い。
本研究では、葉緑体への蛋白質輸送機構を以下のストラテジーで解明することとした。単離葉緑体を用いたin vitro蛋白質輸送実験に際し、立体障害を導入した前駆体蛋白質を用いることで、トランスロコンに前駆体蛋白質が捕捉された膜透過中間体を形成させる。中間体における前駆体蛋白質と相互作用するトランスロコン構成因子の解析により、中間体を構成する因子を同定する。
当該年度は、前年度獲得した上記解析に有用な前駆体蛋白質の改良を行った。概要を以下に記す。 前年度獲得した立体障害を有する前駆体蛋白質は、自発的にイソペプチド結合を形成するSpyCatcher（SpyC）とSpyTag（SpyT）をそれぞれ前駆体蛋白質のC末端とストレプトアビジンのN末端に連結し、両者を大腸菌内で供発現することで立体障害の導入を可能としたが、SpyC内部のイソペプチド結合形成の触媒作用を有する部位が蛋白質輸送の障害となる可能性が指摘された。そこで、触媒部位を除去し、触媒部位のみ別途発現させることで、ストレプトアビジンを立体障害として導入することができた。さらに、前駆体蛋白質中でイソペプチド結合形成部位よりもN末端側に様々な長さのリンカーを導入することで、前駆体蛋白質のN末端から立体障害までの長さの異なる一群の輸送基質を獲得することができるようになったので、現在、これらの輸送基質を用いた蛋白質輸送実験を行い、中間体の単離を試みている。