2018 Fiscal Year Research-status Report
超好熱性アーキアから発見された新規エンドヌクレアーゼによるDNA修復経路の解明
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18K05442
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
石野 園子 九州大学, 農学研究院, 准教授 (80399740)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | DNA修復 / 遺伝子破壊 / DNA損傷 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでにin vitroで損傷DNAに作用することを証明してきたタンパク質をコードする遺伝子について、Thermococcus kodakarensisの遺伝子の多重変異を含む破壊株の作製を進めていった。脱アミノ化損傷に関係する遺伝子ではendoQ、endoMS、endoV、udg、およびAPendoをターゲットとしている。endoQ遺伝子の破壊株に対して、さらにendoV, endoMS, udg, APendoそれぞれの遺伝子破壊を導入し、二重変異株を作製した。また、同様にendoQ、endoMS、endoV、udgそれぞれの遺伝子の破壊株に対してDNA修復に関わると予想されるpolB遺伝子の破壊をおこない、二重変異株を作製した。また停止した複製フォークに関わる遺伝子で互いに相互作用することがわかっているhefとhanについて二重変異株を作製した。それぞれの一遺伝子破壊株において、他の遺伝子の発現量がどうなるのかをRT-PCRを用いて解析した。至適培養条件下ではいずれの遺伝子の破壊株においても、他の遺伝子の発現量に有意な差はみられなかった。
もう一つの課題であるEndoMSタンパク質の修復経路の解明について、T. kodakarensis 由来Mre11、Rad50、HerA、NurAの遺伝子クローニングをおこない、組換えタンパク質の高純度標品を得た。EndoMSによる２本鎖切断後にこれらのタンパク質が、どのように働くのかを調べるために、蛍光標識したオリゴヌクレオチドを用いて基質を作製し、切断反応の解析をおこなった。予想した5’末端の切断ではなく、３‘末端のエキソヌクレアーぜ活性が検出されたが、エンドヌクレアーゼ様の産物も検出されるので、さらなる解析が必要である。
EndoMSと相互作用するタンパク質の探索は、候補となる組換えタンパク質の作製途中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
嫌気性超好熱性アーキアT. kodakarensisの遺伝子操作実験が順調に進行し、二重変異を含む多数の遺伝子破壊株を作製することができたので、遺伝学的解析に向けて、予定以上の種類の破壊株を用いることができるように準備ができた。しかし実験に不可欠な嫌気チャンバーの不具合（故障し、新規更新）のため、様々なDNA損傷を与える薬剤を使用したプレートによる実験ができなかった。その代わりにRT-PCRで遺伝子の発現量解析を実施し、13種類の遺伝子破壊株について、それぞれ10種の遺伝子の発現量解析をおこなった。この実験が順調に進み大量のデータが取得できた。
EndoVとEndoQそれぞれが、脱アミノ化塩基損傷を含むDNAに対して切断した後、PolBが伸長合成して修復を完了させるモデルにもとづいて、in vitroにおける再構成実験を開始しており、三種の組換えタンパク質の調製が終わり、順調に予備実験へと進められた。
またT. kodakarensis 由来Mre11、Rad50、HerA、NurAの組換えタンパク質の作製は、タンパク質精製のステップで、不溶化沈殿等のトラブルがあったが、これにも対応できるようになり、高純度な精製標品を得るための方法を確立することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
多数作製した遺伝子破壊株について、種々の温度における増殖解析を行う予定である。至適温度の85度では差異が見られない株も、90度以上の高温では感受性を示すものがあると期待される。
DNA損傷に用いる薬剤を検討し、表現型を観察できるよう条件検討を行う予定である。
また細胞の変異率の測定を6メチルプリン耐性を利用し定量する実験系を確立させることが当初の計画であるが、次世代シークエンサの利用を視野に入れて、細胞の変異を定量するだけでなく変異スペクトルの解析までできるようにしたい。継代した細胞の変異の蓄積を直接ゲノムシークエンスをすることにより、解析可能であると考えられるので、計画的に継代とゲノム調製をおこない遂行する。
EndoMSの修復経路のin vitroにおける探索は、精製した組換えタンパク質との相互作用解析、切断反応の詳細な解析を引き続きおこなう。相互作用因子の候補で、まだ精製タンパク質を調製できていないものがあるのでそれを進めるとともに、ゲノム上のEndoMSにHisタグを付加して、細胞抽出液から天然の複合体を調製することも検討したい。
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| Causes of Carryover |
主たる研究機器である嫌気チャンバーの故障のため、実験計画を変更して嫌気チャンバーで使用する予定の培地、ガス、プラスチック消耗品類、試薬類の購入をしなかった。代わりの実験で用いた試薬消耗品類の購入で生じた差額を次年度に繰り越した。また培養実験が進まなかったため、予定していた研究打ち合わせを次年度に延期したので旅費を次年度に繰り越した。次年度では大量の継代培養と次世代シークエンスの実施を計画しており、繰り越した次年度使用額を、培地、ガス、プラスチック消耗品類、試薬類の購入と旅費に充てる予定である。
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