2019 Fiscal Year Research-status Report
生体認識配糖体生産のための特異的糖鎖遊離酵素の構造解析とその機能開発
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18K05444
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
伊藤 和央 大阪市立大学, 大学院理学研究科, 准教授 (20183171)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | エンドHS / 立体構造 / エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ / アスパラギン結合型糖鎖 / 生体認識配糖体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
大腸菌でのエンドHS遺伝子の発現系において、メチオニンをセレノメチオニン（Se-Met）に置換した遺伝子組換エンドHS（rEndo HS）を発現するよう培養条件を設定し、大腸菌を培養した。菌体破砕液から硫安分画、疎水、イオン交換およびゲルろ過の各カラムクロマトグラフィーによって組換えSe-MetエンドHS(rSe-Metエンド HS)を精製し、電気泳動的に単一なrSe-Metエンド HS標品を得た。
精製rSe-Metエンド HS標品を濃縮し、結晶化に供した。前年度にrエンド HSを結晶化することができた結晶化条件をもとに、ハンギングドロップによる蒸気拡散法で20℃において結晶化条件を検討した。その結果、複数の条件下で結晶が生成した。得られた条件をもとに、沈澱剤組成・濃度、添加剤あるいは酵素濃度条件を検討し、結晶化条件の最適化を行った。その結果、重層した薄板状の単結晶を得た。得られた結晶は安定で、X結晶回析に適していた。
X線結晶回析強度の測定は、ヨーロッパ放射光施設(SLS)で行った。測定は、SLS X065Aで行った。測定条件は、検出器Pilatus NX、波長0.98オングストローム、カメラ長170 mm、振動角0.50°で合計720枚のイメージデータを収集した。データ処理はXDSで行った。
その結果、空間群がP 212121、格子定数がa =71.7Å、b =135Å、c =237 Åと決定して、1.95Å分解能でフルデータ収集を達成した。また、単波長異常散乱法（SAD 法）によって位相を決定した。得られたデータをもとに立体構造を解明した。
その結果、エンドHSは、GHファミリー85に属するエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの立体構造に類似したドメインとそのC末端側に2つの未知ドメインが結合した新規な立体構造をとることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度は、X線結晶構造解析のためのエンドHSの結晶を調製することができ、構造解析に必要なＸ線結晶回折強度のデータを得ることができた。しかし、新規な立体構造を有する酵素であったため、位相の決定に分子置換法が適用できず、立体構造の解明には至らなかった。そこで、重原子置換法による位相の決定のために結晶の重原子置換を行ってきたが、解析に適した重原子置換体の結晶は未だに得られていない。
一方、エンドHS遺伝子の大腸菌での発現系において、大腸菌の培養条件を変更し、メチオニンをセレノメチオニンに置換したrエンドHS（rSe-MetエンドHS）の発現を行った。その結果、rSe-MetエンドHSを発現することができ、その単結晶を得ることができた。この結晶を用いて、ヨーロッパ放射光施設（SLS）においてＸ線回析強度の測定を行い、SAD法によって位相を決定することができた。得られたデータをもとに、 エンドHSの立体構造を解くことができた。その結果、エンドHSは、GHファミリー85酵素のドメインの他に未知のドメインを2つ有する新規な立体構造をとることが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
エンドHSと基質との複合体の立体構造を明らかにするために、糖タンパク質から調製したアスパラギン結合型糖鎖とエンドHSの共結晶を調製し、そのX線結晶構造解析を行い、酵素・基質複合体の立体構造を明らかにする。そして、エンドHSの糖鎖認識および水分子認識に関わる構造上の特徴を解明し、エンドHSの触媒部位、糖鎖認識・結合部位および加水分解・糖鎖転移部位を特定する。
これらの知見をもとに、遺伝子改変によって糖鎖転移合成型酵素を作成し、その生体認識配糖体合成効率を検証する。また、合成した生体認識配糖体の構造と機能解析を行う。さらに、糖鎖認識改変型酵素の作成と各種生物起源糖タンパク質糖鎖の転移導入と糖鎖転移合成型酵素によるバイオ医薬品糖鎖のリモデリングを検証する。
また、我々が発見したPrevotella melaninogenicaの産生するアスパラギン結合型糖鎖遊離酵素エンドPMは、エンドHSと同様に糖タンパク質からアスパラギン結合型糖鎖のうちコンプレックス型糖鎖を特異的に遊離する。そこで、エンドPMの遺伝子発現系を構築し、遺伝子組換えエンドPMの立体構造を解明し、エンドHSの立体構造あわせてこれら酵素のアスパラギン結合型糖鎖構造の認識機構を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
rSe-MetエンドHSの発現のための培養量が予定していた量よりも少なかったため、培地や添加試薬に関わる経費が少なかった。また、発現酵素の精製に用いるカラムクロマトグラフィーのための充填用樹脂が予定していた量よりも少なく、これに関わる経費が少なくなった。これらの要因のために次年度使用額が生じた。
これは次年度に酵素・基質複合体結晶の調製とそのX線結晶構造解析のための経費に充てる。また、エンドHSによる生体認識配糖体の合成とその構造解析のための物品の購入に充てる。さらに、Prevotella melaninogenicaの産生するエンドPMの精製とその遺伝子クローニングと遺伝子発現系の構築ならびに発現エンドPMの精製と結晶化のために必要な物品の購入に充てる。
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