2023 Fiscal Year Annual Research Report
Structural analysis and developmental research of specific glycosidases for production of glycosides bearing biorecognition
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18K05444
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| Research Institution | Osaka Metropolitan University |
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Principal Investigator |
伊藤 和央 大阪公立大学, 大学院理学研究科, 准教授 (20183171)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 生体認識配糖体 / エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ / 立体構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2018～2022年度は、組換エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(エンド)HSとSe-Met置換組換エンドHSの板状単結晶を調製し、X線結晶回析測定と単波長異常散乱法での位相決定から、分解能1.95Åの立体構造を解明した。エンドHSは、GHF85酵素類似ドメインI～IIIとC末端側の新規ドメインIVとVから構成されていた。
また、分離菌Prevotella melaninogenica 由来エンドPMの3つのアイソザイムのうち、組換エンドPMαの板状単結晶のX線結晶回析から分解能2.1Åの立体構造を解明した。エンドPMαはN末端側からI～V のドメインで構成され、ドメインIは(α/β)8バレルで、触媒アミノ酸が存在する触媒ドメインであった。ドメインII～Vは異なるβバレルで、ドメインIVとVは他のGHF85酵素に存在しなかった。外膜移行モチーフを含むドメインVは、本酵素の菌体外膜移行ドメインと考えられた。低角X線散乱法で解析したエンドPMαの立体構造は非対称形で、実験散乱曲線と理論曲線のχ2 値が異なり、結晶と溶液では構造が異なると考えられた。
最終年度は、GHF85酵素の3つの触媒アミノ酸に相当するエンドHSのN216 、E218、Y252の機能を検証した。1アミノ酸置換N216A、E218Q、E218A酵素の各活性は野生型酵素の1/1000以下で、Y252F酵素は1/7、GHF85酵素ではFであるY282のY282F酵素は1/50となった。2アミノ酸置換N216A/Y252F酵素は野生型酵素の1/10000以下で、N216A/E218QやE218Q/Y252F酵素と3アミノ酸置換N216A/E218Q/Y252F酵素の活性は検出不可であった。エンドHSはE218を中心に、N216、E218、Y252、Y282の4アミノ酸残基が触媒部位を構成していると考えられた。
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