2019 Fiscal Year Research-status Report
New approach for engineering enzymes using accessory proteins
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18K05445
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University |
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Principal Investigator |
田中 俊一 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (70591387)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松村 浩由 立命館大学, 生命科学部, 教授 (30324809)
吉澤 拓也 立命館大学, 生命科学部, 助教 (50779056)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 人工結合タンパク質 / 進化分子工学 / 酵素 / タンパク質工学 / 基質特異性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題の趣旨は、研究代表者らの開発した独自技術『Enzyme Engineering by Proxy（酵素の活性中心付近に結合するアクセサリータンパク質を人工的に創り出し、その結合を介して触媒機能を改変する技術）』の応用可能性を探ることを目的に、①アクセサリータンパク質が酵素の触媒機能を改変するメカニズムの解明と、②基質と触媒機構が異なる複数の酵素を対象とした網羅的検証実験に取り組むことにある。
①について、昨年度までにＸ線回折データの取得に成功しているBacillus circulans由来ベータガラクトシダーゼ（BcBgaDD）とアクセサリータンパク質（BcBgaDD_MbL23）の複合体の構造決定に成功した。当該構造の分解能は2.6Åであった。また、この複合体構造に基質である3糖オリゴ糖を導入した三者複合体について、2.4Å分解能での構造決定に成功した。BcBgaDDとBcBgaDD_MbL23の結合界面に位置する複数のアミノ酸に対して、アラニンスキャニングによる網羅的な変異実験を行うことで、基質特異性改変における重要部位を同定するに至った。さらに、これらの構造学的知見に基づいてBcBgaDD_MbL23に変異を加えることで、BcBgaDDの基質特異性をさらに改良することにも成功した。
②について、昨年度に実施、成功したCandida cylindracea由来リパーゼの基質特異性の改変に引き続き、大腸菌由来ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、大腸菌由来アデニル酸キナーゼ、真菌由来フラクトフラノシダーゼを対象とする検証実験を開始した。いずれの酵素に対しても、複数種類のアクセサリータンパク質が取得できており、今後、基質特異性の改変が可能かどうかを解析していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①アクセサリータンパク質が酵素の触媒機能を改変するメカニズムの解明と、②基質と触媒機構が異なる複数の酵素を対象とした網羅的検証実験、それぞれにおいて計画通りの進捗が見られており、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
①アクセサリータンパク質が酵素の触媒機能を改変するメカニズムの解明
最優先事項として、昨年度と本年度で得られた研究成果をまとめ、国際誌への発表を行う予定である。さらに、Candida cylindracea由来リパーゼとアクセサリータンパク質との複合体の結晶構造解析について、本年度は大型放射光施設の使用停止などの影響もあってデータ取得には至らなかったが、来年度の使用再開とともに鋭意取り組み、構造決定を目指していく。
②基質と触媒機構が異なる複数の酵素を対象とした網羅的検証実験
より多くの酵素に対して研究代表者らの技術の応用可能性を検証するために、大腸菌由来ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、大腸菌由来アデニル酸キナーゼ、真菌由来フラクトフラノシダーゼを対象に、触媒機能の改変を検証する予定である。
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