2020 Fiscal Year Annual Research Report
New approach for engineering enzymes using accessory proteins
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18K05445
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University |
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Principal Investigator |
田中 俊一 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (70591387)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松村 浩由 立命館大学, 生命科学部, 教授 (30324809)
吉澤 拓也 立命館大学, 生命科学部, 助教 (50779056)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 人工結合タンパク質 / 進化分子工学 / タンパク質工学 / 酵素 / 基質特異性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題の趣旨は、研究代表者らの開発した独自技術『Enzyme Engineering by Proxy（酵素の活性中心付近に結合するアクセサリータンパク質を人工的に創り出し、その結合を介して触媒機能を改変する技術）』の応用可能性を探ることを目的に、①アクセサリータンパク質が酵素の触媒機能を改変するメカニズムの解明と、②基質と触媒機構が異なる複数の酵素を対象とした網羅的検証実験に取り組むことにある。
①について、これまでに基質特異性の改変に成功しているBacillus circulans由来ベータガラクトシダーゼ（BcBgaDD）とアクセサリータンパク質（BcBgaDD_MbL23）の複合体のＸ線結晶構造解析に成功した。さらに、この複合体構造に基質である3糖オリゴ糖を導入した三者複合体についてもＸ線結晶構造解析に成功した。これらの立体構造情報と、BcBgaDDとBcBgaDD_MbL23の結合界面に位置するアミノ酸に対する変異解析により、基質特異性改変における重要部位を同定した。さらに、BcBgaDD_MbL23に変異を加えることで、BcBgaDDの基質特異性をさらに改良することにも成功した。
②について、BcBgaDDとは基質と活性中心構造が異なるCandida cylindracea由来リパーゼ（CcLip1）を対象に、アクセサリータンパク質の結合によって基質特異性の改変ができることを実証した。具体的には、野生型酵素は短鎖から長鎖まで幅広い長さの脂肪基質に作用するのに対し、アクセサリータンパク質（CcLip1_MbL18）を結合させると、その基質特異性を短鎖側へシフトできることが実証できた。加えて、大腸菌由来ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、大腸菌由来アデニル酸キナーゼ、真菌由来フラクトフラノシダーゼを対象に検証実験も進め、それぞれ触媒能の変化が確認されている。
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