Artificial regulation of function of transcription factors by organic compounds

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05451
• Research Institution: Yamagata University
• Principal Investigator: 豊増 知伸 山形大学, 農学部, 教授 (60272085)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 14-3-3タンパク質 / bZIP転写因子 / 花成 / フシコクシン / タンパク質-タンパク質相互作用

Outline of Annual Research Achievements

14-3-3タンパク質は、真核生物に普遍的に存在する制御タンパク質で、それそのものには活性はないものの、標的タンパク質とリン酸化依存で相互作用し、その標的の機能を制御する重要なアダプタータンパク質である。シロイヌナズナの花成関連bZIP転写因子であるFDは、C末端のmode1モチーフを介して14-3-3と相互作用し、それとフロリゲンFTとの複合体ができることで花成関連遺伝子の転写を誘導し、花成することが知られている。一方、糸状菌の二次代謝物フシコクシンは、ATPaseのC末端の尻切れ型mode3モチーフと14-3-3との相互作用を安定化することが知られている。そこでこのフシコクシン依存のタンパク質-タンパク質相互作用様式を模倣し、フシコクシン依存的に14-3-3と相互作用する改変FDをタンパク質工学的に創製することを最初の目的とした。その後、この改変FDをシロイヌナズナに組み込み、フシコクシン依存で14-3-3/FTと相互作用させることで人為的な花成制御を目指す計画である。FDの改変は、ATPaseのmode3モチーフを参考にした。FDと14-3-3の相互作用は、組換えタンパク質を用いたin vitroプルダウン法で評価した。その結果、FDのmode1モチーフをmode3モチーフに変え、さらにC末端アミノ酸もATPase同様にAからVにすることでフシコクシン依存的に14-3-3と相互作用する改変FDを作り出すことに成功した。さらに、FDの14-3-3結合モチーフ内のリン酸化標的となるTについては、リン酸化T（最近発見されたFDリン酸化酵素を利用）ではフシコクシン非存在下でもある程度は14-3-3と結合できることが明らかとなり、リン酸化模倣となるE置換する方が14-3-3相互作用のフシコクシン依存度が高く、人為制御には適していると考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

3年計画の中で、初年度において花成関連bZIP転写因子FDについて、フシコクシン依存的に14-3-3と相互作用するように改変するところまでは計画通りに実行できたので、概ね順調である。

Strategy for Future Research Activity

当初の計画通りに、改変FDをシロイヌナズナに組み込み、フシコクシン処理により花成を制御できるかどうかを検討するが、2019年度はその組換え体調製を行う。また、2019年度では、別の14-3-3標的の探索も並行させる計画である。