2018 Fiscal Year Research-status Report
癌の転移と浸潤を抑制するプロアントシアニジン類の合成と化学生物学的研究
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18K05454
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
真壁 秀文 信州大学, 学術研究院農学系, 教授 (90313840)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
梅澤 公二 信州大学, 総合理工学研究科, 助教(特定雇用) (00609258)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | proanthocyaidin / antituor / pyrogallol group / cancer metastasis |
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| Outline of Annual Research Achievements |
プロアントシアニジン類は縮合型タンニンの一種であり，抗酸化活性をはじめとする様々な生物活性を有することが知られている。研究代表者はプロアントシアニジン類の優れた生物活性を特異な構造に着目し，合成研究を行ってきたが，その過程でピロガロール基を持つ化合物が顕著な抗腫瘍活性をを有することを明らかにしてきた。本研究では，未だに合成や生物活性の報告のないピロガロール基を有するエピガロカテキン重合体の合成と構造活性相関の研究を行った。エピガロカテキンオリゴマーのうち4, 5量体は2016年にオクラの種子に含まれていることが報告されているが，単離精製が困難であるため合成研究を行った。合成は以前研究代表者が開発したエピガロカテキンの2量体求電子剤を用いて2量体および3量体の求核剤と亜鉛トリフラートをルイス酸として縮合する方法を試みた。その結果，エトキシエトキシ基を持つエピガロカテキンの2量体求電子剤では反応が全く進行しないことを確認した。そのため様々な脱離基を持つ求電子剤と縮合反応を検討した結果，エチレングリコール基を持つ化合物が縮合反応を起こすことを明らかにした。また，ルイス酸のスクリーニングも行い，亜鉛トリフラートのほかにトリメチルシリルトリフラートでも縮合反応が進行することも見いだした。縮合物は順次保護基の脱保護反応に供し，エピガロカテキン4，5量体の初めての合成を達成した。合成したエピガロカテキン4，5量体に対して，ヒト前立腺癌細胞PC-3株を用いて細胞増殖抑制試験を行った結果，エピカテキン4，5量体と比較して強い活性が認められた。また，癌転移原因遺伝子のfatty-acid binding protein 5(FABP5)の遺伝子発現抑制試験を行ったところ，発現が抑制される傾向が見られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
エピガロカテキンオリゴマー合成例は報告が大変少なく，2013年の研究代表者の2量体の合成が世界で初めてであった。より重合度の高い4量体以上の化合物は縮合反応における反応性が低下することが予想されたため，大変困難と思われたが，求電子体の4位にエチレングリコール基を導入することで解決された。本手法の開発によりエピガロカテキンオリゴマーの合成方法が確立され，研究は順調に進んでいると判断した。ただし，縮合反応の収率が50%弱であるためある程度の量的確保に課題が残されている。一方，研究計画書に記載のプロアントシアニジン類結合タンパク質の探索において使用するFGビーズに結合するための基質および蛍光プローブの合成は試行錯誤の繰り返しであったが，エピガロカテキン2量体の4'位にアミノ基を導入することができた。今後は末端にカルボキシ基をゆうするポリエチレングリコールを結合させることで，アミノ基を有するFGビーズとBODYPYを有するポリエチレングリコールも結合できると考えられるため，エピガロカテキン2量体の抗腫瘍活性を発現するタンパク質の同定や癌細胞内での結合タンパク質の局在を解明するための可視化が可能となると考えられる。以上の結果を総合的に判断して本研究は，「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず，FGビースや蛍光央ローブを用いて癌細胞におけるプロアントシアニジン類結合タンパク質の同定を行う。同定を行った後はそのタンパク質が本当に癌細胞の増殖や転移に関連するのかタンパク質をリコンビナント法によって生産し，機能解析を行う。また，探索研究代表者と研究分担者の梅澤助教はプロアントシアニジン類の標的タンパク質の検索で計算科学的手法も行ってきた。ドッキングシミュレーションの結果，エピガロカテキン3量体(EGC3)が 癌の原因となる変異型K-Rasタンパク質と相互作用するPDEδに強く結合することが示唆された。現在のリコンビナント法によるPDEδの生産の状況ははPDEδの遺伝子組み換え体（Hisタグ付き）を大腸菌BL21株にて発現し、Niカラム精製まで進んでおり，精製PDEδをSDS-PAGEにて確認し，結合試験へ供する準備ができている。今後はアトロバスタチンに蛍光色素を結合させ，アトロバスタチン（蛍光色素付き）と精製PDEδの結合を蛍光偏光法にて確認を行う予定である。これらの実験を通して，EGC3がPDEδと結合するか否かを検証し，癌の抑制につながるか否かを検証する。
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Research Products
(2 results)
