2018 Fiscal Year Research-status Report
Involvement of cytosolic and vacuolar enzymes in plant secondary metabolism
| Project/Area Number |
18K05466
|
|---|
| Research Institution | Toyo University |
|---|
Principal Investigator |
佐々木 伸大 東洋大学, 食環境科学部, 准教授 (80422088)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | ポリアシル化アントシアニン / 糖転移酵素 / アシル基転移酵素 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
高次に修飾されたポリアシル化アントシアニンを持つキンジソウ（Gynura bicolor）の葉から抽出した粗酵素液を用いて、基本骨格である cyanidin（Cy）と cyanidin 3-glucoside（Cy3G）を基質として、UDP-glucoseとmalonyl-CoAを用いた糖転移（GT）反応と、アシル基転移（AT）反応を行ったところ、cyanidin に対する糖転移反応と、Cy3Gに対するマロン酸転移酵素活性が認められた。これらは反応条件から細胞質型の酵素であることが推察された。キンジソウの葉と根から抽出したRNAを用いてRNA-seq 解析を行った。Trinity を用いた de novo アッセンブリによって得られた約11万contigについてBLAST検索を行ったところ、アントシアニンを蓄積する葉だけで発現しているacyl-CoA依存型のAT相同遺伝子を2種類獲得した。また、葉だけで発現していると思われるUDP-glucose依存型GTについて 65 contigを獲得した。また、液胞型GTの相同遺伝子について41、液胞型ATの相同遺伝子については47 contigを獲得した。
キンジソウと同時にポリアシル化アントシアニンをもつ紫キャベツ（Brassica oleracea var. capitata f. rubra）についても研究を進めた。紫キャベツ葉から抽出した粗酵素液を用いて、Cy, Cy3Gを基質として、UDP-glucoseを用いた糖転移反応について検討したところ、Cy3G→Cy3GG→Cy3GG,5Gの順番で糖転移反応が起こることが推定された。紫キャベツとアントシアニンを持たないキャベツの葉を用いてRNA-seq解析を行った。その結果、細胞質型GT：123、 細胞質型AT：15、液胞型AT：149、液胞型AT:47のcontigを獲得した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本申請では、キンジソウや紫キャベツ等の高次に修飾されたアントシアニン分子のの生合成経路を解明し、それぞれの修飾反応を触媒している酵素が細胞質型のものであるか、液胞型のものであるかを明らかとすることが目的である。このため、まずは生合成の順序を決定するとともに、それらの反応がどのような基質を必要とするかを明らかとする必要がある。今年度は、キンジソウではアントシアニン基本骨格から2段階目まで、紫キャベツでは3段階目までの反応を検出することに成功し、これらが全て細胞質型の酵素によって触媒されることを推定した。また、これらの酵素をコードしている遺伝子を同定するために、RNA-seq解析を行い、候補遺伝子の絞り込みを行った。これらのことから概ね当初の予定通り研究は進行しているものと判断される。
|
| Strategy for Future Research Activity |
キンジソウについてはアントシアニン合成の3段階目以降の反応を検出するために、2段階目の反応を大量に行い、3段階目の反応の基質を用意する。具体的には、キンジソウ葉から抽出した粗酵素液を用いてmalonyl-CoAとCy3Gを基質として反応を行い、反応生成物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。精製したものを基質として、acyl-CoAやUDP-glucose、acyl-glucoseを用いて酵素反応を行い、3段階目以降の生合成経路の推定を行う。また、RNA-seq解析によって獲得した各種相同性遺伝子について、それらの発現量等を精査して、さらなる候補遺伝子の絞り込みを行った後に、クローニングを行い、大腸菌発現系を用いて組換え酵素を生産し、それらの酵素活性を評価することによって、各反応を触媒する酵素をコードするcDNAの単離を行う。
紫キャベツについてはRNA-seqで獲得されているアントシアニン合成に関わる相同遺伝子のcontigについて、発現量解析や系統樹解析を行うことで、これまでに検出されている3段階目までの糖転移酵素をコードしていると思われる候補遺伝子の絞り込みを行う。選抜した候補遺伝子についてクローニングを行い、大腸菌発現系を用いて組換え酵素を生産し、それぞれの酵素活性について評価を行うことで、紫キャベツアントシアニン生合成に関与する遺伝子の同定を行う。
|
| Causes of Carryover |
オリゴ合成や分子生物学用酵素がキャンペーンにより当初の予定よりも低額に抑えられたため、若干の繰越が生じた。繰越分については次年度の分生生物学的酵素やキットの購入に充当する予定である。
|
