2018 Fiscal Year Research-status Report
コナダニ類の脂質代謝に関わる酸化的な炭素鎖短縮反応の分子基盤
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18K05468
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| Research Institution | Kyoto Gakuen University |
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Principal Investigator |
清水 伸泰 京都学園大学, バイオ環境学部, 准教授 (30434658)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | コナダニ / 脂質代謝 / 生合成 / Baeyer-Villiger酸化 / ギ酸エステル / 炭化水素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ダニ類は厳しい外的環境にも適応できる脂質代謝機構をもつことで高い生存能力を発揮している。特に動物の必須脂肪酸であるリノール酸の生合成能をもつことは生理学的な重要性だけでなく、様々な生物機能が知られる炭化水素やエステルなどの生合成にも深く関与している。我々はこれまでコナダニ特有の炭化水素やギ酸エステルなどのデノボ合成に着目し、ダニ類に同位体標識化合物を取り込ませるトレーサー実験を行ってきた。その成果として、炭化水素とギ酸エステルはともに脂肪族アルデヒドを経由して生合成されると仮説を立てたことにより、どの生物種からも未発見の酸化的な炭素鎖短縮反応の関与が明らかとなった。そこで今年度は、アルデヒドからBaeyer-Villiger酸化を経てギ酸エステルに変換する酵素を、次の二つのアプローチから同定することを目的に研究を進めた。1) コナダニを大量繁殖させて粗酵素液を調製し、遠心分離法によって得た画分に酵素活性を認めた。界面活性剤を用いて酵素の可溶化条件を決定できたので、硫安による塩析と各種クロマトグラフィーによる精製を進めて、アミノ酸配列を解析する予定である。2) 次世代シーケンサーを用いた塩基配列解析などにより、推定生合成遺伝子群を絞り込んだ。異種発現系により候補遺伝子の酵素機能を調べるため、ダニからmRNAを抽出し、cDNAを合成後、これをテンプレートとして候補遺伝子をクローニングしている。これらをタンパク質発現ベクターに挿入し、大腸菌にて融合タンパク質を異種発現させようと試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新規なBaeyer-Villiger 酸化に関与する酵素の同定を目指した。大量飼育したコナダニから粗酵素液を調製して、遠心分離法によって得た沈殿画分に酵素活性が認められた。酵素活性はアルデヒドを基質として加えてギ酸エステルへの変換の有無で判断した。沈殿画分にTriton X-100を添加すると酵素が可溶化できたため、膜タンパク質および核タンパク質である可能性が示唆された。目的の酵素を同定するもう一つのアプローチとして、トランスクリプトーム解析を行った。本種ダニのようにゲノム配列の分かっていない非モデル生物でもde novo RNA-seq を行うことで、RNA分子の情報を網羅的に調べることができる。得られたトランスクリプトーム塩基配列をもとに既知のBVMOと配列類似性を示すタンパク質を検索したところ、6種のタンパク質が特有のモチーフ配列をもつことが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
粗酵素を用いた活性評価法が確立できたため、今後はさらに硫安による塩析やゲル濾過、各種クロマトグラフィー等による精製を進めて、アミノ酸配列の決定を目指す。また、de novo RNA-seqで得られたトランスクリプトーム塩基配列について、Blast検索を含めたジーンオントロジー解析を行うことで付与されたアノテーションから、既知のBVMOと配列類似性を示すタンパク質を絞り込んだ。現在、異種発現系により候補遺伝子の酵素機能を調べるため、ダニ由来の候補遺伝子をクローニングしている。これが終了し次第、タンパク質発現ベクターに挿入し、大腸菌にて融合タンパク質を異種発現させる。
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| Causes of Carryover |
購入予定であったGC/MS用キャピラリーカラムとHPLC用カラムが所属機関の公費で賄えた。また経費の掛かるトランスクリプトーム解析を他の研究助成金で支払えたため、繰り越した分は2019年度の消耗品、成果発表、委託費などで使用する予定である。
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