2018 Fiscal Year Research-status Report
Effect of acetic acid on the activation of G-protein-coupled receptor GPR43 in skeletal muscle cells and on the skeletal muscle function
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18K05476
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| Research Institution | Okayama Prefectural University |
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Principal Investigator |
山下 広美 岡山県立大学, 保健福祉学部, 教授 (70254563)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 酢酸 / 骨格筋 / GPR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、骨格筋におけるGPR43の脂質代謝における役割の解明、および酢酸による活性化について明らかにすることを目的とした。平成30年度の研究では、L6筋管細胞を用いてその分化過程におけるGPR43遺伝子（ffar2）の発現動態をまず解析した。その結果、分化誘導した筋管細胞では筋芽細胞に比較して、GPR41遺伝子（ffar3）の発現に変化は無かったが、ffar2は有意に増加した。筋芽細胞の分化誘導後経日的にffar2の発現は増加した。分化した筋管細胞に酢酸を添加すると、添加後5－30分後までffar2の発現は経時的に有意に増加した。次に、GPR43の存在を確認する目的で、アゴニスト添加後の細胞内カルシウム濃度の測定を行った。測定はカルシウム検出キットを用いた。96穴プレートに1.5×104 cell/wellのL6筋管細胞を播種し、GPR43アゴニストならびに酢酸をそれぞれ添加した後、経時的にカルシウムレベルの変化を計測した。その結果、アゴニストの添加後速やかにカルシウムレベルが上昇した。また酢酸においても添加後5分経過後から細胞内カルシウムレベルが増加した。そのレベルは酢酸濃度が増加するほど高くなったが、0.5mM以上になると低下する傾向が見られた。酸の濃度が高くなると細胞に他の影響がある可能性が考えられた。一方、GPR43をノックダウンさせた条件でのアゴニストおよび酢酸の影響は消失した。それに対して、GPR43の作用を介さずカルシウムのレベルを上昇させるATPの影響はGPR43をノックダウンさせても変化なかった。動物の骨格筋におけるGPR43遺伝子の発現も確認された。以上より、骨格筋にはGPR43が発現しており、酢酸により活性化されることが強く示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GPR43は、脂肪組織および免疫細胞に高発現しているが、肝臓や骨格筋にはほとんど発現しないと報告されてきたが、本年度の研究においてまず、骨格筋におけるGPR43の発現について調べ、分化した筋管細胞および動物骨格筋においてその発現を明らかにした。当初の計画通りに研究は進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、GPR43アゴニストならびに酢酸によるGPR43活性化を介したAMPKの活性化ならびにエネルギー代謝関連因子の動態解析、またそれら因子の細胞内局在について解析し、酢酸によるGPR43を介した骨格筋の脂質代謝改善ならびに加齢による骨格筋の代謝異常改善の可能性について以下のような計画で検討する。
1．酢酸またはアゴニストによるGPR43の活性化を介したAMPKの活性化ならびにエネルギー代謝関連因子の動態解析
細胞内のカルシウム濃度が増加すれば、カルシウム依存性たんぱく質キナーゼであるCAMKKを活性化させAMPKの活性化が引き起こされると共に、カルシニューリン/NFATc1経路が活性化され筋線維の遅筋化が促進する可能性がある。GPR43のアゴニストならびに酢酸を用いて、GPR43の作用によるAMPKのリン酸化、ミオグロビン、GLUT4遺伝子の発現、MEF2A、PGC1a、NFATc1の核内局在など、酢酸の作用でこれまでに観察されている細胞内分子の活性化を解析するとともに、GPR43のsiRNAを用いてアゴニストおよび酢酸の作用が阻害されるか解析し、骨格筋細胞におけるGPR43の作用について明らかにする。
2．GPR43の作用を介した骨格筋特異的因子群の細胞内局在変化の解析
MEF2A、PGC1a、NFATc1の細胞内局在を抗MEF2A抗体、抗PGC1a抗体、抗NFATc1抗体および蛍光標識二次抗体を用いて染色し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析する。
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| Causes of Carryover |
消耗品等の低価格時期の購入と合理的な使用計画により節約できた。
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