Preparation of monoclonal antibody against nivalenol

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K05489
• Research Institution: Kagawa University
• Principal Investigator: 川村 理 香川大学, 農学部, 教授 (30204770)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ニバレノール / モノクローナル抗体 / トリコテセン系マイコトキシン / ELISA

Outline of Annual Research Achievements

ニバレノール(nivalenol, NIV)は、代表的なタイプBトリコテセン系マイコトキシンで、動物やヒトに対して嘔吐、下痢、食欲不振や免疫不全などの症状を引き起こし、国内産の小麦や大麦を高頻度に汚染している。代表的なマイコトキシンの1つであるNIVに対する特異的モノクローナル抗体(ｍAb)の作製は未だ報告されていない。そこで、NIVのオキシム化を行いカルボキシ基を導入後、キャリーアー蛋白質を結合させｍAbの作製を行った。
NIV-oximeを合成し、分取HPLCで精製した。NIV-oximeを水溶性カルボジイミドを用いて卵白アルブミン(OVA)と反応させNIV-oxime-OVAを作製し、ELISAの固相抗原として用いた。また、N-ヒドロキシスクシンイミド法でカチオン化ウシ血清アルブミン(cBSA)と結合させてNIV-oxime-cBSAを作製し、これを免疫原としてBALB/cマウスを免疫した。
NIVに対する抗体価の上昇を確認できたので、これれらのマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞の細胞融合を行った。　　HAT選択後、スクリーニングを行い抗NIV抗体生産細胞を選択して、限界希釈法で2回以上のクローニングを行い安定な抗NIVｍAｂ生産ハイブリドーマを19クローン得て、NIV.1～19と命名した。初めてNIVに特異的なmAbの作製に成功した。
これらの抗体のうち、比較的NIVとの反応性の高かった5つのmAbのNIV関連化合物との反応性を調べた。その結果、NIVに特異的に反応するNIV.9抗体、15-アセチルDONと交差反応性を示すNIV.12と13抗体、および、15-アセチルDONと強い交差反応性を示し、DONとも弱い交差反応性を示すNIV.10と11抗体を得た。NIV.9と10抗体を用いた競合ELISAでは1 ng/mLまでのNIVの検出が可能であり、簡便かつ高感度なNIVの測定法の開発が期待された。