2018 Fiscal Year Research-status Report
がんの予後改善に向けた新戦略：食品成分による浮遊細胞へのアノイキス誘導機序の検討
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18K05536
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| Research Institution | The University of Shiga Prefecture |
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Principal Investigator |
遠藤 弘史 滋賀県立大学, 人間文化学部, 助教 (30567912)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | アノイキス / 癌幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がんの予後を決める転移や再発・浸潤は，癌細胞が足場から離れると誘導される細胞死誘導(アノイキス)に対して抵抗性を獲得することが大きな要因である．つまり，がんの治療において，このような性質を持ったCSCとEMT癌細胞にどのように効果的に細胞死を誘導できるかが重要な課題となっている．そこで本研究の目的は，がんの予後に影響するCSCとEMTをおこした癌細胞の両方を併せてAnchorage-Independent Cancer Cell Group (AICCG)と呼び，食成分がAICCGに細胞死を誘導する詳細なメカニズム明らかにすること．さらに，in vitro，in vivoの両面から抗癌剤と食成分の併用による腫瘍抑制効果の検討を行うことを目的として研究を計画した．当該年度は，A549の抗癌剤処理と食成分処理における浮遊生存細胞数を定量的に解析するため，低接着シャーレに細胞を播種して浮遊培養をおこない，MTTアッセイを用いてAICCGと上皮型癌細胞における抗癌剤と食成分による細胞増殖抑制作用の差を定量的に明らかにした．具体的には，食成分の一つであるクルクミンは足場非依存性を獲得した癌細胞に対しても14-3-3蛋白質およびAktの発現を抑制することで，アポトーシスを誘導することを明らかとした．また，癌悪性化の大きな要因と考えられているCSCに対しても細胞死を誘導することを見出している．
以上の二点からいくつかの食品成分は癌の原発巣に対する抑制効果のみならず，転移や浸潤を抑えている可能性も示唆される結果となっている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H30年度とH31年度前半はin vitroにおける解析を中心におこなう．A549とCaco-2の抗癌剤処理と食成分処理における浮遊生存細胞数を定量的に解析するため，細胞培養上清を遠心分離して食品成分および抗癌剤の処理時間と処理濃度を変えて，トリパンブルー染色による生存細胞数計測をおこなう．次に低接着シャーレに細胞を播種して浮遊培養をおこない，MTTアッセイを用いてAICCGと上皮型癌細胞における抗癌剤と食成分による細胞増殖抑制作用の差を定量的に明らかにする．アノイキスの原因となることが知られている活性酸素種(ROS)の産生をシグマ社のDC-FHDAを用いてFACS Caliburで測定する．また，ROSから細胞を保護するGSHの抑制が起こっているかどうかをプロメガ社のGSH-Glo Glutatione Assay kitを用いて検討する．ストレス蛋白質Hsp70は，ROS抵抗性を有することが知られているので，Hsp70のsiRNAによるノックダウンと過剰発現させることでその効果を明らかとする．加えて，我々がこれまで明らかにしてきた食成分による細胞死誘導とAICCGが同じメカニズムで起こっているかを検討する．食成分と抗癌剤による癌細胞の遊走・浸潤能抑制効果を検討する．これを定量的に測定するために，AICCGを接着型に培養して8 μm孔のポリカーボネート膜を使用したBoyden Chamber Cell Migration / Invasion AssayとWound Healing Assayにより評価すとしていた．
当該年度は上記の計画に対して，後半部分の癌細胞の遊走・浸潤能抑制効果についての検討は行えていないが，食品成分の浮遊癌細胞に対する抑制効果の責任分子を同定するに至っており，これらのことを鑑みておおむね順調であると考える．
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は前年度計画で試行することができていない以下の点について検討する．まずアノイキスの原因となることが知られている活性酸素種(ROS)の産生をシグマ社のDC-FHDAを用いてFACS Caliburで測定する．また，ROSから細胞を保護するGSHの抑制が起こっているかどうかをプロメガ社のGSH-Glo Glutatione Assay kitを用いて検討する．ストレス蛋白質Hsp70は，ROS抵抗性を有することが知られているので，Hsp70のsiRNAによるノックダウンと過剰発現させることでその効果を明らかとする．加えて，我々がこれまで明らかにしてきた食成分による細胞死誘導とAICCGが同じメカニズムで起こっているかを検討する．食成分と抗癌剤による癌細胞の遊走・浸潤能抑制効果を検討する．これを定量的に測定するために，AICCGを接着型に培養して8 μm孔のポリカーボネート膜を使用したBoyden Chamber CellMigration / Invasion AssayとWound Healing Assayにより評価する．加えてH30年度に繰り上げて行っていたCSCに対する食品成分の効果について，具体的な細胞内メカニズムを明らかにすることで，その後の動物実験への展開の基礎データ収集を行う予定である．
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| Causes of Carryover |
今年度予定していた研究計画において，ストレス蛋白質Hsp70は，ROS抵抗性を有することが知られているので，Hsp70のsiRNAによるノックダウンと過剰発現させることでその効果を明らかとすることと，我々がこれまで明らかにしてきた食成分による細胞死誘導とAICCGが同じメカニズムで起こっているかを検討するため，食成分と抗癌剤による癌細胞の遊走・浸潤能抑制効果を検討する．さらに，これを定量的に測定するために，AICCGを接着型に培養して8 μm孔のポリカーボネート膜を使用したBoyden Chamber Cell Migration / Invasion AssayとWound Healing Assayにより評価する二点が未着手であったため，予定よりも使用予算が少なくなった．この予算は次年度に実行する予定であり，予算もそれに使用する．
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