デジタルLAMP法による簡易迅速遺伝子定量技術の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K05543
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 高畠 令王奈 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品研究部門, 上級研究員 (20463466)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: LAMP / DNAプローブ / GMO / 検知

Outline of Annual Research Achievements

DNAプローブを用いたLAMP増幅産物の検出等、デジタルLAMPに適した検出法を検討した。DNAプローブは既にリアルタイムPCRにも利用されているが、最も一般的なTaqMan法は、標的DNAの増幅を行うDNAポリメラーゼの酵素の種類が異なること等から、LAMPには原理的に適用できない。また、そもそもLAMPは標的の増幅産物の大きさが一定でないこと等から、PCRで一般的に行われている多検体の同時検出が困難であった。そこで、今年度は、蛍光消光現象（QP：Quenching phenomenon）を利用した核酸プローブであるQProbeを用いてLAMP増幅産物の検出を試みた。具体的には、LAMP法において必須である４種類のプライマーセット（F3、B3、FIP、BIP）に加えて、F2プライマーとB2プライマーの内側にQProbeを設計した。多くのGM作物に導入されているカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（P35S）やダイズの内在性配列であるLectin1（Le1）等を標的に複数のQProbeを設計し、検出の可否を検討した。LAMP増幅産物の検出には、等温増幅蛍光測定装置Genie IIIを用いた。その結果、それぞれの標的を特異的に検出可能な系の開発に成功した。また、これらの検出系において、P35SおよびLe1を同時に検出する目的で、それぞれのプライマーセットと、蛍光波長の異なる２種類のQProbeを混合したところ、二つの標的を同時に検出することも可能であった。以上の結果から、LAMP増幅産物のDNAプローブによる蛍光検出が可能であること、さらに、二種類の標的を同時に検出可能であることが示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の目標であったDNAプローブによるLAMP増幅産物の検出に関しては、QProbeを導入することによって可能となった。ただし、QProbeは蛍光が消光していく様子を観察する系であることから、デジタル解析にはやや不向きである。今後は、蛍光が増幅していく系が開発できないか、DNAプローブを用いた系に関してさらなる検討を進める必要がある。

Strategy for Future Research Activity

DNAプローブを用いたLAMP増幅産物の検出に関して、QProbeだけでなく、Molecular Beacon等、LAMP技術に適用可能と予想される様々な技術の導入を試みる。最終的には、デジタルLAMPに最適な検出系を採用し、デジタルLAMP検出法を完成させる。さらに、開発した検出法に関して、定量限界等の性能評価を行い、デジタルPCRとの性能比較を行う。

Causes of Carryover

当初は、３０年度に様々なDNAプローブを検討し最適な系を決定する予定であったが、最初に試したQProbeで良好な結果が得られたことから、３１年度に検討予定であった多検体同時検出の検討まで実施してしまった。しかしながら、QProbe以外の蛍光検出系、とくにLAMPの反応が進むにつれ蛍光が増幅する様な系の方が、本研究課題には相応しいことから、３１年度には、Molecular Beacon等、新たなDNAプローブを導入する予定である。