Development of rapid digital quantitative technology using loop-mediated isothermal amplification

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K05543
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 高畠 令王奈 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品研究部門, 上級研究員 (20463466)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 定量分析 / LAMP / DNA / 簡易迅速

Outline of Annual Research Achievements

昨年度から引き続き、デジタルLAMPに適した検出法の検討を行った。デジタル定量を実施するためには、二種類以上の増幅産物を識別可能な検出技術が必要である。デジタルPCRに利用されているPCRの検出系では、蛍光プローブを用いたTaqMan法が利用されており、プローブの蛍光波長によって標的由来の増幅産物を識別することが可能となっている。一方、LAMPでは、鎖置換型のDNAポリメラーゼを使用していることから、TaqMan法が使用できない。そこで、ヘアピン型プローブであるMolecular Beaconの適用を試みた。多くの（遺伝子組換え）GM作物に挿入されているカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（P35S）を標的としたプローブの5’側を蛍光物質FAM、3’側をクエンチャーDabcylで修飾したMolecular Beacon用プローブを設計し、LAMP反応液に添加したところ、LAMPの増幅に伴い蛍光の増幅が確認された。また、ダイズの内在性配列であるLectin1（Le1）を標的に、プローブの5’側を蛍光物質ROX、3’側をクエンチャーDabcylで修飾したMolecular Beacon用プローブを設計し、検出の可否を検討したところ特異的に検出可能であった。同様に、トウモロコシの内在配列であるStarch Synthase IIb（SSIIb）についても、5’側を蛍光物質ROX、3’側をクエンチャーDabcylで修飾したMolecular Beacon用プローブを設計し、検出の可否を検討したところ特異的に検出可能であった。
これらの検出系を用いて、実際のGMダイズやトウモロコシの試料を分析したところ、P35Sを標的とした場合、0.5%のGMダイズRRSあるいはGMトウモロコシまで検出可能であった。
また、P#5S用と内在性配列Le1あるいはSSIIbの検出用プライマーセットを混合した場合、組換え配列と内在性配列を同時に検出可能であった。